近期，浙江大學高分子系高長有教授和浙江大學醫學院附屬第二醫院葉娟教授在科愛出版社的Bioactive Materials期刊上聯合發表研究論文：一種兼具強韌性、抗菌和抗氧化能力的水凝膠敷料（PAHT），通過抵抗感染和減輕氧化應激促進傷口愈合并降低瘢痕（HSs）形成。
增生性瘢痕（HSs）通常出現在深部皮膚損傷后，給患者的生活造成了極大的不便。HSs的產生和發展與傷口愈合過程密切相關，當炎癥階段持續或傷口愈合延遲時，就會導致HSs等病理性瘢痕的出現。本質上講，HSs是網狀真皮的炎癥性疾病，其特征是炎癥反應延長、血管生成過度以及肌成纖維細胞和膠原蛋白的過度積累。細菌感染和氧化應激是導致炎癥的兩個典型因素。目前針對HSs的敷料研究往往忽視了細菌感染的潛在影響。考慮到細菌感染的多發性和廣泛性，有必要明確感染情況下HSs的預防和治療。
在此，該研究提出了一種強韌水凝膠敷料，以促進感染傷口的愈合并控制瘢痕的形成。水凝膠基質由聚乙烯醇（PVA）和瓊脂糖的雙網絡結構構成，為水凝膠的力學性能提供強力支撐，并負載超支化聚賴氨酸（HBPL）和單寧酸（TA）賦予水凝膠具備抗菌和抗氧化能力（圖1）。
圖1 抗菌和抗氧化水凝膠敷料加速感染傷口愈合、減少增生性瘢痕的形成。
一、水凝膠的制備與表征
制備了五種類型的水凝膠敷料（表1）。以PAHT水凝膠為例，制備方法如下：在110 ℃下，機械攪拌下將20 wt% PVA1799和2 wt%瓊脂糖溶解在76.2 wt%水中；冷卻至90 ℃后，加入1 wt% HBPL（博慧（浙江）生物技術有限責任公司）和0.8 wt% TA，調節pH至6；完全溶解后，將溶液澆鑄到模具中，并冷卻至室溫，然后將其在-20 ℃下冷凍4小時，并在室溫下解凍1小時，此過程重復3次。其他水凝膠按照類似的過程制備。
表1 本研究制得的各水凝膠簡稱及組成
合格的水凝膠敷料應具有足夠強韌的力學性能。與單網絡PVA水凝膠相比，所有雙網絡水凝膠的抗拉性均有顯著提高。HBPL的添加實現了較大程度的增強，而TA的效果較小。當HBPL和TA同時存在時，拉伸模量最大，而斷裂伸長率和斷裂強度略有下降，表明它們的增強效果似乎具有拮抗作用（圖2A-E）。在壓縮測試中，所有水凝膠都沒有破碎，只產生了少量的塑性變形；所有雙網絡水凝膠的抗壓性均高于單網絡水凝膠（圖2F-H）。PAHT水凝膠具有良好的耐疲勞性能，在20次循環拉伸和壓縮測試中未觀察到明顯的塑性變形，滯后環小（圖2I, J）。這些結果證明，雙網絡水凝膠PAHT表現出良好的力學性能，在應用中不會破裂或失效。
圖2 水凝膠的機械性能。（A）不同組分水凝膠的拉伸應力-應變曲線。（B）PAHT水凝膠拉伸試驗照片。（C）不同水凝膠的拉伸模量、（D）斷裂伸長率和（E）斷裂強度。（F）不同組分水凝膠的壓縮應力-應變曲線。（G）PAHT水凝膠壓縮試驗照片。（H）不同水凝膠的壓縮模量。PAHT水凝膠的循環拉伸（I）和壓縮（J）曲線。
水凝膠敷料通常設計用于吸收傷口環境中的滲出物。然而，過度吸水會導致水凝膠體積的極度膨脹和力學性能的急劇下降，不利于其對傷口的持續保護。PAHT水凝膠具有良好的抗溶脹性，且溶脹平衡后仍然保留足夠大的力學性能（圖3A, B）。另一方面，水凝膠敷料可以為傷口愈合提供有利的濕環境。當未施加保護膜時，PAHT水凝膠所含的水分快速流失（圖3C）。然而，在實際應用中，傷口敷料通常覆蓋有一層保護膜，可以抵抗污染并保持水分。因此失水率將大大降低，不會影響水凝膠應用。
水凝膠中的功能組分HBPL和TA是通過物理作用負載的，可以在傷口環境中釋放。當HBPL和TA單獨存在時，可實現快速釋放；當HBPL和TA共存時，由于二者之間的靜電相互作用以及TA與水凝膠基質分子間的氫鍵作用，釋放速率減緩（圖3D, E）。值得一提的是，在體內應用中，由于液體量更少，HBPL和TA的釋放速度要慢得多，因此預計功能性會更持久。
圖3 水凝膠的理化和生物學性質。（A）PAHT水凝膠的溶脹能力和（B）溶脹后的拉伸性能。（C）PAHT水凝膠的保濕能力。（D）HBPL和（E）TA的累積釋放。水凝膠對（F）DPPH、（G）·OH、（H）·O2−和（I）H2O2的清除效果。與水凝膠孵育后（J）MRSA和大腸桿菌菌落的照片，以及（K，L）相應抗菌率的定量計算。水凝膠的（M）細胞和（N）血液相容性。
二、水凝膠的抗氧化能力、抗菌能力和生物相容性
減輕傷口的氧化應激對于減少隨后的瘢痕形成至關重要。由于TA優異的抗氧化能力，含有TA的PAT和PAHT水凝膠對DPPH、·OH、·O2−和H2O2具有高效的清除效果，HBPL中氨基的還原性也貢獻了部分抗氧化能力（圖3F-I）。
細菌感染是傷口炎癥的重要原因，阻礙傷口愈合并加重瘢痕形成。分別以MRSA和大腸桿菌作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌為代表進行測試。PA水凝膠沒有抗菌效果，由于TA的存在PAT水凝膠具有一定抗菌能力，而加入HBPL的PAH和PAHT水凝膠可以殺死幾乎所有細菌（圖3J-L），表明HBPL的高效抗菌性能。HBPL的抗菌性主要來源于其豐富的氨基通過靜電作用對細菌細胞膜的破壞。
傷口敷料必須安全無害。因此，分析了水凝膠的細胞相容性和血液相容性，均呈現出良好的安全性（圖3M, N）。
三、水凝膠促進感染傷口愈合的效果
為評價PAHT水凝膠敷料治療體內創面的效果，建立了MRSA感染的全層皮膚缺損大鼠模型（圖4A）。含HBPL的水凝膠抗感染能力十分突出，PAHT組愈合最快，12天時傷口幾乎完全閉合（圖4B-D）。從收集的傷口組織中分離出細菌，分析各組的體內抗感染能力。與宏觀觀察結果一致，對照組和PA組的傷口中存在大量細菌，PAT組的細菌數量減少，而PAH和PAHT組的細菌含量最低（圖4E, F）。
圖4 水凝膠促進MRSA感染的傷口愈合效果。（A）傷口愈合實驗方案。（B）不同時期用不同水凝膠治療的感染傷口的代表性圖像。（C）傷口愈合過程動態圖，以及（D）傷口面積的定量分析。（E）不同水凝膠治療后傷口中MRSA含量的定量計算，以及（F）相應的菌落照片。
ELISA結果顯示，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達在所有治療組中均下調，其中抗菌和抗氧化功能最強的PAHT組下調最為顯著（圖5A–C）。相應地，抗炎因子IL-4和IL-10在所有治療組中均上調，尤其是PAHT組（圖5D, E）。這些結果表明PAHT水凝膠在體內抗炎方面具有顯著的功效。
通過病理染色對傷口愈合進行更詳細的分析標明，在整個愈合過程中，PAHT組的炎癥浸潤最輕，組織再生和膠原沉積最好（圖5F）。眾所周知，血管生成在傷口愈合中起著重要作用，而CD31可以代表新血管的形成。免疫組化染色和相應的定量分析結果表明，PAHT水凝膠治療顯著提高了CD31的表達（圖5G, H）。這些結果表明，抗菌和抗氧化敷料在加速傷口閉合和表皮再生、促進膠原沉積和血管生成方面具有很強的積極作用，從而為皮膚傷口恢復提供了有力的支持。
圖5 大鼠傷口組織的ELISA和組織學分析。傷口中（A）TNF-α、（B）IL-1β、（C）IL-6、（D）IL-4和（E）IL-10炎癥因子的表達水平。（F）傷口愈合過程中的H&E和Masson染色。（G）第12天傷口組織的CD31免疫組織化學染色，以及（H）定量分析。
四、水凝膠抑制增生性瘢痕形成的效果
建立了兔耳增生性瘢痕模型（圖6A）。前4周的創面愈合階段與大鼠模型結果基本一致。在第4周結束時，在對照、PA和PAT組中觀察到明顯的紅色瘢痕。之后，瘢痕逐漸穩定，隨著時間的延長顏色逐漸減退。在所有組中，PAH組和PAHT組的瘢痕外觀最接近正常皮膚（圖6B）。
圖6 水凝膠抑制MRSA感染傷口的增生性瘢痕形成的效果。（A）增生性瘢痕實驗方案。（B）在不同時期用不同水凝膠治療的傷口閉合和隨后的瘢痕形成和穩定的代表性圖像。
H&E染色（圖7A）顯示隨著水凝膠功能的增多，HSs厚度逐漸減小，瘢痕抬高指數（SEI）顯示出相同的趨勢（圖7B, C）。HSs的形成與膠原蛋白的過度沉積密切相關。Masson染色計算的膠原體積分數（CVF）表明，經水凝膠治療后，膠原蛋白的過度沉積受到明顯抑制（圖7D）。膠原纖維的類型對皮膚形態至關重要，通過偏振光顯微鏡觀察天亮星紅染色樣品，發現對照組中幾乎沒有III型膠原蛋白；用功能性水凝膠治療后，III型膠原蛋白的比例增加。此外，肌成纖維細胞的過度活動會導致HSs形成和進一步的攣縮。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）作為成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的標志物，在HSs中特異性過表達。免疫熒光染色顯示對照組中α-SMA表達尤為明顯；隨著水凝膠功能的增多，α-SMA的表達逐漸降低，PAHT組的狀態最接近正常皮膚。總之，PAHT水凝膠可發揮顯著抑制HSs生成的作用。
圖7 兔耳瘢痕組織的組織學分析。（A）各組的H&E染色、Masson染色、天狼星紅染色（偏振光顯微鏡觀察）和α-SMA免疫熒光染色。H&E染色中（B）瘢痕厚度和（C）瘢痕抬高指數（SEI）以及Masson染色中（D）膠原體積分數（CVF）的定量分析。
進行RNA測序探討PAHT水凝膠加速感染傷口愈合和抑制HSs生成的潛在機制。正常組、對照組和PAHT三組的主成分分析顯示轉錄組譜存在顯著差異（圖8A）。火山圖顯示出對照組與正常組、PAHT和對照組的差異基因數量（圖8B, C）。基因熱圖顯示，與正常組相比，與免疫和炎癥反應相關的基因在對照組中顯著上調；經PAHT水凝膠治療后，這些基因的表達恢復到接近正常組的水平（圖8D）。對對照組與正常組上調、PAHT和對照組下調的基因取交集，并利用KEGG分析潛在的信號通路，發現差異基因顯著參與與宿主防御、免疫調節和炎癥通路相關的信號通路（圖8E）。綜上，PAHT水凝膠促進傷口修復并減少HSs形成的機理是減少感染和控制炎癥。
圖8 PAHT水凝膠抑制增生性瘢痕形成的機理分析。（A）正常組、對照組和PAHT三組的主成分分析。（B）對照組與正常組和（C）PAHT與對照組的差異基因火山圖。（D）差異基因熱圖。（E）對照組與正常組中上調、PAHT與對照組中下調交集基因的KEGG通路分析。
五、總結
過PVA和瓊脂糖構建雙網絡結構，加入HBPL和TA制備了PAHT水凝膠，具有抗菌、抗氧化功能，能夠促進傷口愈合并抑制后續HSs生成。水凝膠的制備工藝簡單易重復，相關原料安全、價格低廉、應用廣泛。通過力學實驗驗證了其優異的強度、韌性和抗疲勞性能，證明了雙網絡結構的有效性。該水凝膠能夠快速去除ROS，并對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現出有效的殺滅能力。在大鼠傷口模型中，PAHT水凝膠顯示出促進傷口愈合、殺死體內細菌、減少炎癥和促進組織再生的能力。在兔耳瘢痕模型中，PAHT水凝膠對抑制HSs形成有顯著影響。具體而言，PAHT水凝膠能夠減少瘢痕厚度，減少膠原沉積，調節膠原纖維類型并下調α-SMA的產生。RNA測序表明，PAHT水凝膠的良好效果主要源于其有效抵抗MRSA從而緩解炎癥反應的能力。綜上所述，PAHT水凝膠具有廣闊的轉化前景，將在感染創面的抗瘢痕形成領域發揮關鍵作用。
原文信息
Xiaoqing Liu1, Yiming Sun1, Jie Wang, Yongyuan Kang, Zhaolong Wang, Wangbei Cao, Juan Ye*, Changyou Gao*.
A tough, antibacterial and antioxidant hydrogel dressing accelerates wound healing and suppresses hypertrophic scar formation in infected wounds.
Bioactive Materials, 34 (2024) 269-298. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.12.019.
