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嘉峪檢測網 2025-04-02 08:07
1. 實驗步驟
1.1 樣本采集和處理
收集新鮮血液樣本在4℃條件下離心（如3000~4000 × g,15 min），血漿則位于上層，形成清晰的分層，而血液中的其他細胞成分（如紅細胞、白細胞、血小板等）沉淀到離心管底部。
將分離得到的血漿轉移到新的無菌離心管中。如果不立即進行外泌體提取，可將血漿樣本分裝保存在-80℃冰箱中，凍融次數一般不超過2次，否則會降低血漿RNA的提取率。
1.2 外泌體的分離
1.2.1超速離心法（常用方法之一）
將血漿樣本在4℃下進行第一次低速離心300 × g，10 min，去除血漿中的細胞碎片。
取上清液進行第二次離心2000 × g，10 min，進一步去除較大的顆粒，如血小板等。
將上清液轉移到新的超速離心管中，在4℃，100000 × g，超速離心90 min，使外泌體沉淀在管底。
棄去上清液，保留外泌體沉淀，用RNase-free Water重懸外泌體。
1.2.2 試劑盒法（如基于聚合物沉淀的試劑盒）
根據試劑盒說明書，按比例將適量的沉淀試劑加入血漿樣本中，充分混勻。
4℃孵育30 min或者過夜使外泌體沉淀。
1500 × g，離心30 min收集外泌體沉淀，棄去上清液，用Rnase-free Water重懸外泌體。
1.3 外泌體RNA的提取
1. 裂解外泌體
向含有外泌體沉淀的離心管中加入適量的裂解液，充分混勻，使外泌體裂解，釋放RNA。
2. RNA提取操作步驟
1）試劑盒法提取
根據所選用的RNA提取試劑盒的具體步驟進行操作。將裂解后的樣本轉移到吸附柱中，4℃ 12000 × g，離心30 s，使RNA吸附在吸附柱上。
用洗滌液洗滌吸附柱，12000 × g，離心30 s，重復洗滌2次，去除雜質。
最后，向吸附柱中加入60℃預熱的Rnase-free Water或洗脫液，靜置2 min左右；
4℃ 12000 × g，離心1 min，收集洗脫下來的RNA溶液。
2）TRIZOL提取法
利用相分離的原理，向裂解后的外泌體樣本中加入等體積的Trizol試劑，充分混勻。
室溫靜置5 min，使核酸蛋白復合物充分裂解。
然后，加入氯仿（Trizol體積的1/5），劇烈振蕩30 s，室溫靜置10 min。
之后，4℃ 12000 × g，離心15 min，溶液分為三層，RNA在上層水相中。
將上層水相轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，冰上沉淀10 min。
4℃ 12000 × g離心10 min收集RNA沉淀。
配置75%濃度的乙醇洗滌RNA沉淀3次，4℃ 7500 × g離心5 min，小心棄去乙醇。在通風櫥內干燥5~10 min也可將離心管倒扣在吸水紙上，離心管壁上無明顯水滴即可，干燥時間過長可能會導致后續溶解RNA比較困難。
最后，用60~80 μL的RNase-free水或DEPC水溶解RNA，保存至-80℃備用。
2. 注意事項
2.1 樣本采集與處理
采集血液樣本時，避免溶血，通常使用含乙二胺四乙酸（EDTA）或者枸櫞酸鈉等抗凝血劑的真空采血管。
因為紅細胞破裂會釋放出大量的RNA酶，導致外泌體RNA降解。血漿樣本在保存和處理過程中要避免反復凍融，每次凍融會導致外泌體的損失和RNA的降解，使用過程需在冰上融化。
2.2 防止RNA降解
整個操作過程要在無RNA酶的環境中進行。
使用經DEPC處理過的耗材（如離心管、槍頭）和RNase-free Water。
操作要迅速，樣本置于冰盒上，要避免樣本長時間暴露在室溫下，尤其是在裂解外泌體后，因為RNA酶在室溫下活性較高。
2.3 外泌體分離方法的選擇與優化
超速離心法雖然是分離外泌體的經典方法，但對設備要求高，操作較為復雜。
如果采用試劑盒法，要根據樣本類型和實際情況選擇合適的試劑盒，并通過預實驗進行優化。
不同的外泌體分離方法可能會對后續RNA提取的質量和產量產生影響，要綜合考慮分離效率和RNA完整性。
2.4 RNA提取質量檢測
提取得到的RNA要進行質量檢測，如通過瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性，一般能夠看到清晰的18S和28S條帶，但方法容易導致RNA容易降解，使用的儀器、試劑均需要用DEPC水處理或者配置。
為了便利，通常直接使用Nanodrop微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值應在1.8~2.0之間。
圖1瓊脂糖凝膠電泳 （created in snappgene）
在正常的RNA瓊脂糖凝膠電泳結果中，從加樣孔開始，向凝膠的正電極方向，會依次出現28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA的條帶。
其中，28SrRNA的條帶位置在離加樣孔較近的地方，18SrRNA條帶在28SrRNA條帶的下方（即離加樣孔稍遠的位置），5SrRNA條帶則離加樣孔最遠。
如果RNA質量較好，沒有發生降解，28SrRNA條帶的亮度應該是18SrRNA條帶亮度的約2倍（即28S:18S約為2:1），且兩條條帶都比較清晰，沒有明顯的彌散現象。
這表明RNA的完整性良好，沒有受到核酸酶等因素的破壞。
2.5 操作規范與安全
在進行超速離心等操作時，要嚴格按照離心機的操作規范進行，確保儀器安全和操作準確。
操作人員要佩戴手套和口罩，防止樣本污染和自身接觸有害物質例如Trizol試劑、異丙醇、氯仿或者氯仿替代物等均需要通風櫥內操作。
來源：實驗老司機
