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1. 實驗概述

細胞共培養技術常常被用于探究細胞間相互作用、疾病模型構建、藥物研發等方面，例如細胞共培養體系能夠模擬體內復雜的細胞微環境，通過顯微鏡可以直觀觀察不同類型細胞在共培養時的行為變化，如細胞遷移、黏附、分化等，深入了解細胞間的信號傳導機制。下面介紹用顯微鏡觀察細胞共培養時常見的問題和一些經驗分享。

2. 經驗分享

2.1 實驗操作

2.1.1 細胞接種與培養

細胞比例

根據實驗目的和細胞特性確定合適的共培養細胞比例。比如在研究腫瘤細胞與免疫細胞相互作用時，可能需要按照不同的比例將腫瘤細胞和免疫細胞進行接種，一般可先從1:1、1:2、2:1等比例嘗試，通過預實驗確定最佳比例。

接種密度

要保證細胞在培養過程中有足夠的生長空間和營養物質，同時避免細胞過于稀疏或密集影響觀察效果。例如對于大多數細胞，12孔板的接種密度應為：5×104~105/cm2個細胞。

培養條件優化

不同細胞對培養條件要求不同，需摸索出適合共培養細胞的最佳培養條件。如一些細胞需要5% CO?，而另一些可能需要更高或更低的濃度；培養溫度一般為37℃，但有些特殊細胞可能需要微調。

2.1.2 顯微鏡選擇與使用

顯微鏡類型

根據觀察需求選擇合適的顯微鏡。相差顯微鏡適合觀察活細胞的形態和結構；熒光顯微鏡（徠卡Leica）可用于觀察細胞內特定熒光標記的蛋白、核酸等；共聚焦顯微鏡（ZEISS蔡司）則能實現對細胞的三維成像，更清晰地觀察細胞內部結構和細胞間的相互作用。

參數設置

調整合適的光照強度、對比度、焦距等參數。對于較厚的細胞共培養樣本，可適當降低光照強度，避免過度曝光；通過調整對比度使細胞結構更清晰；使用微調旋鈕精確聚焦，以獲得清晰的細胞圖像。

圖像采集

選擇合適的相機和采集軟件，設置合適的采集參數，如分辨率、曝光時間等。一般來說，高分辨率的圖像有助于觀察細胞的細節，但文件大小也會相應增加。曝光時間要根據細胞的熒光強度或對比度進行調整，避免圖像過亮或過暗。

2.2常見問題解析

2.2.1細胞生長狀態不佳

原因：可能是培養基成分不合適、血清質量差、培養條件不滿足細胞需求或細胞本身狀態不佳等。

解決方法：更換合適的培養基和血清，嚴格控制培養條件，如溫度、CO?濃度等；對細胞進行復蘇、傳代等操作時，要確保操作規范，避免細胞受到損傷。

2.2.2 細胞混雜或污染

原因：細胞接種過程中操作不規范，如未嚴格遵守無菌操作原則，導致細菌、真菌或其他細胞污染；或者細胞株本身不純。

解決方法：接種細胞時要在超凈工作臺內進行，嚴格消毒雙手和實驗器材；定期對細胞進行支原體等檢測，一旦發現污染，及時丟棄受污染的細胞，重新復蘇或購買新的細胞株。

2.2.3 觀察到的細胞形態異常

原因：可能是細胞受到外界因素刺激，如藥物處理、培養環境改變等；也可能是細胞處于不同的生長階段或發生了病變。

解決方法：分析細胞形態異常是否與實驗處理有關，若與藥物處理有關，可調整藥物濃度或處理時間；同時，與正常細胞形態進行對比，判斷細胞是否發生病變或分化。例如BV2細胞、RAW264.7細胞等在正常狀態下均呈現較小的細胞體，呈圓形或橢圓形，若受到外界環境的刺激例如細菌或真菌污染，均可長出觸角。

2.2.4 熒光信號弱或背景高

原因：熒光標記物的濃度過低、熒光淬滅、細胞固定或透化處理不當、抗體非特異性結合等都可能導致熒光信號弱或背景高。

熒光淬滅，信號弱，背景高

熒光強度過高，續需調低曝光度

解決方法：優化熒光標記物的濃度，避免熒光標記物長時間暴露在光下導致淬滅；嚴格按照細胞固定和透化的操作步驟進行處理；選擇特異性高的抗體，并進行預實驗確定最佳抗體濃度。