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概述

環氧化合物（結構見圖1）通常作為原料藥或原料藥中間體合成中使用非常廣泛的起始物料，例如抗凝藥物利伐沙班中，利用 (S)-2,3-環氧丙醇來合成其關鍵中間體，S-環氧氯丙烷則是利奈唑胺原料藥合成中用到的一個關鍵起始物料。由于環氧化物三元環的剛性結構，環張力較大，具有很高的反應活性，在藥物合成過程中易與胺基、有機金屬試劑、鹵代化合物、芳香化合物、氰化物等親核試劑發生反應而開環，環氧化物的兩個親電性碳原子能夠與DNA結構中的親核中心反應，形成烷基化產物，導致DNA突變而危害人類健康。

圖1.環氧化合物結構圖

環氧化物具有警示結構，是已知的潛在基因毒性雜質，其結構種類繁多，是基因毒性雜質中較為常見的一類。藥品生產過程中是否有環氧化合物的殘留已成為基因毒性雜質是現階段藥物研究過程中重要討論和控制的內容，也已成為國內外藥品注冊審評不可缺少的項目。由于環氧化合物在高溫下極易容易分解，給分析方法的建立帶來了巨大的挑戰。

根據參考各國藥典及文獻，總結了部分含有環氧化合物類基因毒雜質藥物的種類，詳見表1。

表1. 含有環氧化合物類基因毒雜質藥物列表

常用的檢測方法：

直接檢測法：

對于具有一定揮發性的環氧化合物，如環氧乙烷，因其具有很強的揮發性，所以氣相色譜法是此類基因毒雜質的主要檢測分析手段。有文獻報道，采用GC-FID法直接測定阿莫卡蘭中的環氧乙烷的殘留量，其LOD為0.09 μg/g，可達到較高的精密度和靈敏度。近年來，對環氧氯丙烷（ECH）雜質檢測方法報道也比較多，常用氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法直接進行檢測。

對于非揮發性環氧化物則采用液相色譜法進行檢測。文獻顯示，采用HPLC-UV法分別檢測地塞米松中的一對差向異構體16α-甲基環氧化物和16β-甲基環氧化物，兩者的分離度大于3，LOQ均為30 ng/mL。

衍生化法：

環氧化合物化學性質不穩定，且有些環氧化物是中性分子，不容易在ESI離子源中質子化和去質子化，因此無法通過MS檢測器來直接檢測。當樣品不能直接進樣分析時，為了滿足分析方法的要求，通常會選擇柱前衍生的方法，將其轉化為容易質子化的化合物或具有強紫外吸收的化合物，從而提高環氧化合物的檢測靈敏度。據文獻報道，采用二甲胺作為衍生化試劑，結合ESI-MS檢測方法對原料藥中的環氧化物進行了殘留量的測定，LOD能夠達到1ng /mL。也有不少文獻采用3,5-二氟芐胺、N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺、亞硫酸鈉等作為衍生化試劑測定水中或者其他基質中的環氧化合物，通過借鑒這些方法并進行方法優化，則也可以應用于藥物中環氧化物基因毒雜質的測定。

其他方法：

衍生化法并不適用于所有環氧化合物，特別是含有多個親電基團的環氧化合物，如：(2R)-2-[(5-溴-2,3-二氟苯氧基)甲基]環氧乙烷、(R)-對甲苯磺酸縮水甘油酯等，衍生化反應可能會生成多個產物，給檢測帶來巨大困難與挑戰，為了能夠有效檢出，這類化合物可以采用配位離子噴霧質譜（CIS-MS）法直接法進行測定，在CIS-MS中，環氧化合物中性分子在溶液中或者氣相狀態下容易轉變為帶正電或者帶負電的化合物，能夠有效提高其檢測靈敏度。

案例

鹽酸普洛萘爾：

鹽酸普洛萘爾（Propranolol，化合物1，圖2），是β受體阻斷類藥物中的代表藥物，在臨床上廣泛應用于心律失常、心絞痛等疾病。在鹽酸普洛萘爾的合成工藝（圖2）中，一般以α-萘酚與環氧氯丙烷（ECH）作為起始原料，得到中間體4，之后中間體4在異丙胺中發生開環反應得到中間體5，最后在加熱回流環境中進行鹽酸化處理反應制得鹽酸普洛萘爾成品。鹽酸普洛萘爾的合成工藝中使用到的環氧氯丙烷（化合物3，圖2）具有警示結構，為已知的基因毒性雜質，因此必須對其進行嚴格控制。

圖2. 鹽酸普洛萘爾的合成工藝

因此，采用GC-FID的方法測定環氧氯丙烷。根據ICH指南要求，對該方法進行了檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準確性等相關驗證，環氧氯丙烷在2 ppm~11.25 ppm的范圍內成良好的線性關系，相關系數R2=0.9985，環氧氯丙烷的LOD和LOQ分別能夠達到0.5 ppm及2 ppm，平均回收率為97.2%，該方法靈敏度非常高、操作簡單且無機制干擾，適合在痕量水平下對鹽酸普洛萘爾中基因毒雜質環氧氯丙烷進行控制。

卡維地洛:

卡維地洛（Carvedilol，化合物6，圖3）是由德國Boehringer Mannheim公司開發的第三代β受體阻滯劑，該藥于1991年首次在美國上市。卡地維洛的合成是以4-羥基-9H-咔唑（化合物7，圖3）為原料，在強堿催化下，反應形成中間體8，然后中間體8與另一個中間體2-（2-甲氧基苯氧基）乙胺（化合物9，圖3）反應得到卡維地洛成品。事實上，該合成工藝的中間體4-(2,3-環氧丙氧基)-9H-咔唑（化合物8，圖3）含有環氧化合物的警示結構，具有潛在的遺傳毒性和致癌性，因此，依據EMA和FDA相應的指導原則，有必要對卡維地洛中的4-(2,3-環氧丙氧基)-9H-咔唑的殘留進行定量分析。根據ICH發布基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 μg/d計算，卡維地洛最大日劑用量為100 mg/d，則對應的基因毒性雜質4-(2,3-環氧丙氧基)-9H-咔唑的TTC水平為15ppm。

圖3. 卡維地洛合成工藝

因此，采用LC-MS直接檢測的方法對4-(2,3-環氧丙氧基)-9H-咔唑進行定量，在該方法下LOQ 為2.68 μg/g，LOD 為 0.825 μg/g，在0.2~22.5 μg/g的濃度范圍內均成良好的線性關系，相關系數R2=0.9995，回收率為96.7-101.5%。該方法快速、簡單、準確且經全面驗證后符合檢測的需求。

總結

環氧化合物作為潛在的基因毒性雜質，通常作為起始物料或中間體存在于藥物合成過程中，這些物料通常會作為雜質存在于終產品中，可能具有遺傳毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，藥品中如果含有上述種類的基因毒性雜質，就需要對其進行嚴格的控制。由于環氧化合物種類繁多，且化學性質各異，因此需從靈敏度、選擇性、待測物穩定性、基質復雜性等進行全方面分析，選擇合適的分析檢測手段。

值得注意的是，有時采用基因毒性物質作為起始物料或反應試劑是不可避免的，除此之外，還會涉及到合成工藝流程的方方面面以及包括隨后的藥品的穩定性和可能的降解雜質，這是一個極其復雜的過程問題，因此對基因毒性雜質的有效控制是不可忽視的。不得不承認，基因毒性雜質研究是一件非常富有挑戰性的工作，它涉及到工藝化學、毒理學數據采集分析、化學分析方法的建立和有效檢測，因此，我們要盡可能地明確藥品中存在的各類基因毒雜質的結構、來源以及質控限度，建立一個科學可行的分析方法，從而有效保證藥品的質量安全。

本文根據以下文章進行編輯整理，僅用于學習、交流：

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2.Rao M. S , Sumathi V. R, Ray U.K., et al. Quantification of 4-Oxiranyl Methoxy 9h-Carbazole a Genotoxic Impurity in Carvedilol Drug Substances by LC-MS[J]. Journal of Bioanalysis & Biomedicine, 2010, 2(4) : 091-095.

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