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嘉峪檢測網 2025-02-27 09:03
摘要
元素雜質的研究和控制對于保障藥物的質量和安全性具有重要意義,國際人用藥品注冊技術協調會(ICH)已發布實施ICH Q3D指南作為藥物中元素雜質研究和控制的全球協調統一的指南。基于 ICH Q3D 指南對元素雜質風險評估和控制的要求,元素雜質檢測方法的開發和驗證是分析工作者的關注重點。該文主要綜述電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)和電感耦合等離子體,質譜法(ICP-MS)方法開發的要點,包括確定待測元素種類和限度、前處理方法選擇、干擾和校正:具體分析ICH Q2(R2)與各國藥典通則關于元素雜質測定方法的驗證要求,并詳細對比說明各項驗證試驗的評價方式,為元素雜質檢測方法的開發和驗證提供參考,同時也為相關研究工作者提供研究思路。
【關鍵詞】元素雜質；ICH Q3D；電感耦合等離子體原子發射光譜法；電感耦合等離子體-質譜法
藥物的雜質分為有機雜質、無機雜質和殘留溶劑，無機雜質中一個重要的類別為元素雜質。一般情況下元素雜質不能為患者提供任何治療作用，而且由于某些元素雜質具有毒性,積累到一定量后可能引起健康風險，另有些元素可能影響藥品的穩定性,對藥品的有效期產生不利影響。為了保證患者用藥安全，以及藥品的質量可控性,需對元素雜質進行風險評估與控制.
國際人用藥品注冊技術協調會(The Intemmationa Councilfor Harmonisation of Technical Requirements forPharmaceuticals for Human Use，ICH)于2014年11月正式發布實施《Q3D:元素雜質指導原則》,并于 2022年4月更新至 Q3D(R2)[1]。ICH Q3D 指導原則依據元素的毒性及在藥物中出現的可能性對元素雜質進行了分類,提供不同給藥途徑(口服、注射、吸人、皮膚)下元素雜質的安全性評估原則，并介紹基于風險評估原則的藥物中元素雜質的評估和控制方法。根據ICHQ3D 指南,元素雜質檢測方法可用于元素雜質風險評估和質量控制。早期采用的重金屬檢測法因專屬性和靈敏度均較差、不能對單個元素雜質進行定量分析等缺點[2]，已不能滿足 ICH 指南對元素雜質控制的要求。隨著分析技術的發展，已有多種現代儀器方法被用于元素雜質檢測，如原子吸收光譜法(atomicabsorption spectrometry ，AAS)[4-5]、X熒光光譜法(Xray fluorescence ,XRF)[6-7]、電感耦合等離子體原子發射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emissionspectromety，ICP-AES)[89]、電感耦合等離子體-質譜法(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICPMS)[8-10] 等，其中 ICP-AES 和 ICP-MS 是美國藥典United States pharmacopoeia，USP)<233>推薦的兩種檢測方法，中國國家藥典委員會發布的《元素雜質指導原則》(第三次公示稿)也指出ICP-AES 和 ICP-MS是同時測定多種元素雜質的常用方法。為了更好地開展元素雜質風險評估,制定適當的質量控制策略,科學合理地進行元素雜質檢測方法的開發及驗證至關重要。因此，筆者在本文對 ICP-AES 和 ICP-MS 的方法開發基本思路以及方法學驗證要求進行了探討,以期為相關研究人員提供參考。
1.ICP-AES 和 ICP-MS
ICP 是一種通過隨時間變化的磁場電磁感應產牛電流作為能量來源的等離子體源。通過ICP 源的光譜分析等離子體原子組分的方法即是ICP-AES，而當ICP 源用作質譜分析的離子源，分析組分的方法即是ICP-MS。ICP-AES 和 ICP-MS 的共同優點是測試元素范圍廣，靈敏度高，可以同時快速分析多種元素，并且具有較寬的動態線性范圍，是各國藥典主要推薦的元素雜質檢測方法。但由于檢測系統的差異，ICP-MS 與ICPAES 的靈敏度存在差距，ICP-MS 的檢測靈敏度更高最低可以達到 10-9水平，而 ICP-AES 僅能達到 10-6水平，故 ICP-MS 更適用于痕量和超痕量元素分析[2-3]。
盡管 ICP-AES 和 ICP-MS 有很多優點，但采用ICP-AES 和 ICP-MS 測定元素雜質會受到光譜和非光譜干擾的影響。與ICP-AES 比較，ICP-MS 受到的干擾更多。研究顯示，由于空間電荷效應[11]，導致 ICP-MS中存在明顯的信號抑制現象，殘留碳含量高的消化劑[12-13]導致某些元素分析信號增強或抑制，以及由(Ar)和碳(C)組成的多原子離子[14]影響鉻(Cr)同位素的測定等多種類型的干擾問題。因此，采用ICP-AES 和 ICP-MS 分析元素雜質之前應充分了解藥品的成分，識別潛在的干擾，并選擇適宜的校正方式。
2.方法開發
2.1 確定待測元素種類
藥品中元素雜質有多種來源，可依據 ICH Q3D 中方法全面評估元素雜質的潛在來源,主要包括原料藥、輔料、生產設備、生產用水、包裝材料等，每一種來源的潛在貢獻都需考慮，以確定元素雜質對藥品的整體貢獻情況。在了解潛在來源的基礎上，需結合給藥途徑、劑型特點、組成成分的理化特性、生產工藝等信息，確認各潛在來源中需要研究的元素雜質種類。ICH Q3D[1]中指出，針對所有給藥途徑，對于有意添加的 1、2A、2B 和(或)3 類元素都需要進行風險評估。針對非有意添加的元素，則需按不同給藥途徑的要求進行分析評估。其中，對于口服給藥途徑，需分析評估1類和2A 類元素；對于注射給藥途徑，需分析評估 1類和 2A 類元素,以及3 類元素中的鋰(Li)、銻(Sb)、銅(Cu)；對于吸入給藥途徑，需分析評估1類、2A 類元素，以及全部3類元素。此外，對于液體和半固體制劑，元素雜質從包裝系統中浸出的可能性高，通常需對此來源的元素雜質進行評估。
2.2 確定各元素的限度
ICH Q3D 中提供 24 種元素雜質在不同給藥途徑下的每日允許暴露量(pemmmitteddaily exposure,PDE)，并且為了更便于進行藥品或其組分中元素雜質含量的評估，提供4種將 PDE 值轉換為濃度限度的計算方式，在所獲得的濃度限度能夠確保藥品不超過 PDE 值的前提下，研究者可選擇任意方法。對于 ICH Q3D 中未列出 PDE 值的元素，可以按照 ICH Q3D 附錄1中提供的方法，利用動物研究結果建立暴露限度。此外，也可以參考官方發布的其他指南確定限度，如歐洲藥品評價局(European Agency for Evalution of Medical Prducts，EMEA)發布的金屬催化劑或金屬試劑殘留限度指南(EMEA/CHMP/SWP/4446/2000)[15] 中列出鐵、錳、鋅的 PDE 值;美國食品藥品管理局( Food and Drug Administration,FDA)發布的21 CFR 73.1200(c)[16]規定藥品中鐵的 PDE 值21CFR 201.323[17]規定全靜脈營養液中鋁的限度值。
2.3 前處理方法選擇
大多數情況下，元素雜質在藥品中通常以痕量或微量的濃度存在，且存在于相當復雜的基質中。因此，ICP-AES 和 ICP-MS 檢測需要開發適宜的樣品制備程序，以降低樣品制備過程中的元素損失和二次污染風險。USP<233>規定了4種優選的前處理方法，包括直接測定法、直接溶解法(水溶液)直接溶解法(有機溶液)、間接溶解法，其中直接溶解法和間接溶解法應用最為廣泛，但由于需要分析的藥物種類繁多，該通則并未給出詳細的樣品制備方法。一般而言，分析人員應根據樣品的性質選擇合適的樣品制備方法并對方法進行確認，而不應簡單地以樣品溶液是否澄清為依據。此外，在選擇適當的稀釋劑/溶劑來溶解樣品成分或用于消解樣品的試劑時，需考慮樣品的化學穩定性和揮發性，以及待測元素的穩定性，避免引起目標元素的損失。表1匯總近年來一些文獻報道的不同結構特征原料藥以及不同類型藥物制劑采用ICP-AES 和(或)ICP-MS 檢測元素雜質的樣品制備方法。
2.3.1 直接溶解法
直接溶解樣品的方法簡單、操作步驟少，且元素雜質損失較少，是首選的樣品制備方法，尤其是對于可溶于水的樣品。水溶性樣品如無機鹽，可采用稀硝酸直接溶解，或用濃硝酸溶解后再加水稀釋以降低酸的濃度，硝酸濃度通常在 1%~10%。在一些情況下，可以加人較低濃度(0.1%~1%)的鹽酸比如在檢測汞( Hg)(Ⅱ)[40]、鈀(Pd)(Ⅱ)[41]或鉑(Pt)(W)[42]的離子時，鹽酸可作為一種絡合劑穩定上述離子，避免在樣品引人系統的延遲及任何記憶效應，或者在鋨(0s)檢測中加人鹽酸保持其穩定性!。汞元素的檢測中，金(Au)(Ⅲ)離子也可以起到類似鹽酸的作用,使汞元素在樣品中保持穩定,并降低測量過程中的記憶效應[43]。
對于不溶于水的樣品，可用有機溶劑進行溶解，其檢測儀器需要采用膜去溶劑化裝置或者霧化器通入氧氣[8] 。常用的有機溶劑包括 N,N-二甲基甲酰胺[44]二乙二醇單乙醚[45] 、2-丁氧基乙醇[46]、乙醇[47]等，但是對于 ICP-AES 和 ICP-MS 而言，過多有機物進人系統內易導致霧化器和等離子矩管積碳、積鹽，進而影響儀器靈敏度，因此需加人水盡可能地降低有機溶劑的濃度。
2.3.2 間接溶解法
不能直接溶于水或有機溶劑的樣品，尤其對于以不同成分(原料藥、包衣、填充劑、粘合劑)以及不同劑型(片劑、膠劑、凝膠劑、軟音劑)存在的藥物制劑，通常需采用消解方法消解樣品，從而使其完全溶解，同時需注意最終樣品溶液中的殘碳量要相對較低，以降低測量過程中出現干擾的可能性[48]。間接溶解法包括敞開式消解法和密閉消解法，敞開式消解法易導致揮發性元素的損失，同時可能引入外部環境的污染，因此一般推薦采用密閉消解法制備樣品，可最大限度降低揮發性元素的損失。
酸的選擇應基于樣品的基質，優先選擇硝酸消解，也可以采用鹽酸、硫酸、氫氟酸，或硝酸與其他酸的混合酸(如王水[鹽酸:硝酸=3:1])。當樣品中含有氧化硅、二氧化鈦或滑石粉時，可以加入氫氟酸將其完全溶解[49]，不過需確認儀器是否適用于氫氟酸進樣，對于一些易揮發性元素，可添加穩定劑保證結果準確，如汞(Hg)元素的檢測中加人0.5%~5%鹽酸或 Au3+離子[50]，鋨(0s)元素檢測中加人含有 0.01 mol·L-1硫脲及0.1g·L-1維生℃的 0.5% 乙酸[51]、含有0.009 mmol·L-1KBr0;的 1% 鹽酸溶液]或0.01 mol·L-1硫脲[40]。在加壓密閉容器中進行微波輔助濕法消解也可以減少元素的損失，同時還可以提高方法的準確度和重復性[36]，目前已成為難溶性藥物的常見樣品制備方法[21-24,26-28,30,32,36-37,39]。此外，需要注意的是，若消解后供試品溶液酸度較大，則需要趕酸以保證供試品溶液酸度與標準溶液一致，同時消解后趕酸也可以起到保護儀器的作用。
2.4 千擾和校正
ICP-AES 在測量過程中可能會由于分析譜線的重疊而產生光譜干擾，為了追蹤這些干擾并選擇無干擾的分析譜線，可以將特定元素的測量結果與使用其他替代譜線得出的結果進行比較[50]。STOVING 等[43]在對 LU(代號)藥片 18 種元素雜質檢測研究中，每種元素都選擇3種分析譜線進行測定，并通過加標回收率的相對標準偏差(RSD)驗證結果以及目測評估，最終除銥(Ir)、Os、Pb、Pt 和銠(Rh)外，其他元素都選擇出發射強度高且無光譜干擾的分析譜線。
ICP-MS 同樣會受到光譜重疊的干擾，其中最常見的類型為多原子離子干擾，通常與所使用的等離子體/霧化器氣體、溶劑/樣品中的基質成分、樣品中的其他元素或周圍空氣中夾帶的氧/氨有關[52] 。現代 ICP-MS儀主要通過碰撞池和/或反應池來消除或減少來自于等離子體和基質的多原子離子干擾[53]，目前常見的碰撞氣體有氦(He)和氙(Xe)，反應氣體有氧氣(02)、氨氣( NH3)、甲烷(CH4)和氫氣(H2)等。已有文獻報道使用 NH3的動態反應池測定原料藥、口服片劑、腸外溶液中的元素雜質時，避免鉻、銅、錳、釩的多原子干擾[54]；使用 He 的碰撞池測定肝素鈉中的元素雜質時避免K、Cr、V、Fe、As 和 S的質譜干擾[55]。另外一種消除光譜重疊的有效方法是使用基于不同質量分析器(扇形磁場、飛行時間和離子阱等)的高分辨質譜儀，其通過較高的分辨能力來有效解決多原子離子和同位素干擾問題，但由于操作技術的復雜性、以及儀器自身和運行維護的成本較高，只有少數專業實驗室在使用[56]同質異位素干擾也是 ICP-MS 中一種常見的質譜干擾除上述解決方式外，在一些情況下也可通過選擇合適的同位素來消除此類干擾。王妮等[57]通過為 Cd、Sb、Pb選擇合適的測試同位素，成功地分析3者在氟比芬酯脂微球注射液玻璃包裝中的遷移量。此外,在等離子體中引人混合氣體(如 Ar 與 N2、02的混合氣體)[45]，以及一些新的樣品引人系統，如冷蒸汽發生、氫化物發生、膜脫溶，冷等離子體技術等[54,58] 也已有報道用于解決光譜干擾。
對于 ICP-AES 和 ICP-MS 測量中存在的非光譜基質干擾，當元素檢測靈敏度可以保證時，降低基質效應最簡單的方法就是樣品稀釋，或者也可以選擇合適的樣品引入系統，如使用V形槽霧化器來分析總溶解體量含量較高的樣品溶液。標準加人法則是通過在供試品溶液中加入不同濃度的待測元素標準溶液，來校正樣品的基質效應。謝莉等[9]采用標準加人法-ICP-MS 測定了氫化可的松注射液中的21 種元素雜質,各元素回收率均在 90%~110%，方法準確度較好。引人內標元素也是校正基質效應的一種常用方法，內標的作用是補償不同樣品之間基質成分的差異，校正與樣品溶液氣動霧化有關的物理干擾以及可能受基質成分影響的傳輸過程。在使用 ICP-AES 時，通常對所有測量元素使用一種內標，如鈧(Se)或釔(Y)。但對于ICP-MS，由于所測定元素信號的抑制或增強幅度與質量有關，一般需要多個內標才能覆蓋整個質量標樣，因此通常為低、中、高質量數元素選擇內標 3 或4個[50]劉宇澄等[28]采用 ICP-MS 分析蘭索拉唑原料藥中元素雜質，測定 Li、Co、V、Ni 時以45Se 為內標，測定 Cd、Sh時以103Rh 為內標，測定 Pb、Hg 以193Ir 為內標。需注意的是樣品中應不含有內標元素，且內標元素與待測元素的質量數應相接近。另外，通過調節儀器參數(如樣品提升速率、霧化氣流速、射頻功率、采樣深度和離子透鏡電壓等)雖然不能消除基質效應，但是在一定程度上可以降低基質效應的影響程度。
3.分析方法驗證
藥物分析方法驗證實施通常主要參考ICH Q2、USP <1225>以及《中國藥典》通則 9101。2023年 11月發布的 ICH 02(R2)擴大適用的檢測方法類型，并且為了適應更多類型的方法，對于方法學驗證的要求也進行了較大的修訂。ICH Q2(R2)現已適用于ICP-AES和 ICP-MS 方法，同時為了更好地指導分析人員運用該指南理念進行方法驗證，在指南附件2中也提供ICP-AES 或 ICP-MS 測定元素雜質的驗證方式示例，但需說明的是該示例并非強制性要求。除 ICH Q2(R2)之外各國藥典通則,包括 USP <233>、USP <730 >、歐洲藥典(European phammacopoeia,EP)2.4.20 EP 2.2.58.和《中國藥典》通則 0412 也都有方法學驗證的相關內容。此外，我國藥典委員會發布的《元素雜質指導原則》(第三次公示稿)(下文統稱藥典委員會公示稿)中也介紹元素雜質方法學驗證的一般要求。表2匯總對比上述指南中關于元素雜質測定方法的方法學驗證要求。
3.1 專屬性
采用ICP-AES 和(或)ICP-MS 法進行元素雜質檢測時，可能存在不同來源的干擾，需對方法的專屬性予以驗證。USP 和EP 相關通則中均明確要求在其他成分(如其他元素雜質、基質成分、其他干擾源)存在的情況下，分析方法應當能夠準確檢測每種目標元素。ICH Q2(R2)和藥典委員會公示稿的示例中提供需要考察的干擾源包括空白試劑、供試品基質、載氣、其他元素和雜質，藥典委員會公示稿更進一步強調若基質存在干擾，應采取有效措施消除干擾或使干擾降至忽略不計。
3.2 范圍
ICH Q2(R2)版中，將線性、范圍下限(定量限、檢測限)統一并人范圍項下，強化了范圍的重要性，對于 ICP -AES 和 ICP-MS 方法，被測元素濃度與響應之間呈線性關系，ICH Q2(R2)示例中要求線性驗證至少5個濃度，這與藥典委員會公示稿要求相一致，并且ICH Q2(R2)正文規定對于線性響應需提供數據圖、相關系數或決定系數、Y 軸截距和回歸線的斜率。但是，ICH Q2(R2)正文及示例部分、藥典委員會公示稿均未對相關系數做出規定，USP、EP、ChP 相關通則均明確要求相關系數不低于0.99。此外，鑒于藥品中的元素雜質通常以較低水平存在，因此方法的靈敏度評價非常重要。各通則/指南對于范圍下限的驗證均包括定量限、檢測限，其中 ICH Q2(R2)和藥典委員會公示稿提出的驗證方法最為全面，包括直觀評估法、信噪比法基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法，不過藥典委員會公示稿未給出各方法的具體要求，ICH Q2(R2)正文中則明確采用信噪比法時，一般可接受的檢測限信噪比為 3:1，定量限信噪比至少為 10:1；采用基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法時，檢測限為3.3σ/S定量限為 10σ/S(σ =響應值的標準偏差；S=標準曲線的斜率)。對于范圍下限與元素限度值(PDE)之間的關系，ICH Q2(R2)未予以規定，僅明確對于雜質檢查，分析方法的定量限應等于或低于報告閾值，而EP24.20 明確規定檢測限不得過限度值的0.5倍，定量限應低于限度值：USP<730>對定量限的要求則更為嚴格需至少達到50%限度值。另外需要提醒的是，ICH Q3D中規定元素 PDE 的 30%為控制閾值，其作為是否需對藥品元素雜質進行額外控制的判斷指標，從這個角度而言，如需使用控制閾值時，元素雜質分析方法的定量限則不能超過 PDE 的 30%。
3.3 準確度
ICH Q2(R2)版示例對于方法的準確度驗證僅簡單說明了采用雜質的加標研究或與正交方法對比雜質譜，但在其正文中舉例可以在3個濃度各重復測定3次進行驗證，并且說明在某些情況下，如果精密度、范圍內響應和專屬性已經確證，方法準確度可以通過推論得出。USP、EP 及藥典委員會公示稿對于確度的驗證要求則相對具體很多且基本一致，即供試品加標溶液配制3個不同濃度，添加水平通常在50%~150%限度濃度范圍內，各元素每個濃度的平均回收率應在 70%~150%范圍內。在上述要求基礎上，藥典委員會公示稿對于加標濃度還予以更為細致的說明，包括加標溶液為高、中、低3個濃度水平且每個濃度至少制備3份樣品，并且指出當供試品中元素雜質含量較低時，可設計更低的濃度點如報告閾值水平。
3.4 精密度
方法精密度驗證包括重復性、中間精密度、重現性3個方面。①重復性:ICH Q2(R2)示例提供兩種驗證方式,一種方式是在可報告范圍內取3水平各重復測定3次，另一種方式是 100%試驗濃度測定6 次。對于第一種方式，可以引用準確度的驗證結果這也符合 ICH Q2(R2)正文中對于準確度和精密度可以合并評價的建議。EP 2.4.20、藥典委員會公示稿同樣提出了上述兩種驗證方式，并進一步要求每個元素茶質測定結果的 RSD≤20%。②中間精密度：USP、EP通則及藥典委員會公示稿對于中間精密度的要求基本一致，變動因素均包括不同時間、不同分析人員、不同儀器，ICH Q2(R2)版則在上述因素基礎上增加了不同環境條件的要求。中間精密度的具體可接受標準在ICH Q2(R2)正文及示例中均未給出具體規定，但USP、EP 和藥典委員會公示稿均明確要求測定結果的RSD≤25%。③重現性:重現性在 USP、EP 通則中均末提及，但藥典委員會公示稿說明在方法轉移或方法復核時，應考察方法的重現性。ICH Q2(R2)則是在正文中說明遞交申請時通常不需要考察重現性嗎，但當分析方法需要收載到藥典中以及在多個場地使用時，則應考慮予以研究。
3.5 耐用性
對于方法耐用性驗證,藥典委員會公示稿和 ICH Q2(R2)示例中給出了一些可微調的參數，包括樣品消解程序、樣品制備中所用關鍵試劑( 如酸、堿)的量或濃度、霧化器和鞘流設置、等離子體設置。藥典委員會公示稿在耐用性項下還提出了供試品溶液的穩定性驗證。
總之，在良好方法開發的基礎上，ICP-AES 和 ICPMS 用于藥物元素雜質檢測還需通過全面的方法學驗證，分析人員可以依據 ICH Q2(R2)及各國藥典相關通則證實方法的科學性及適用性。
4.結論與展望
自 2014 年 ICH Q3D 發布,經過 10 年的發展，基于風險評估對元素雜質控制的理念，有效促進了藥品整體質量水平的提高。ICP-AES 及 ICP-MS 方法以靈敏度高和專屬性強等優點，如今已廣泛用于藥物中元素雜質的檢測并進行風險評估和質量控制。本文綜述了這兩種方法在元素雜質檢測方面的方法開發要點和具體的方法學驗證原則，可提高分析方法開發的效率，有助于保證分析結果的準確性和可靠性。值得重點關注的是，目前藥品前處理方法還是需要具體問題具體分析，由于藥品的基體具有類似性，因此對前處理方法規律進行歸納總結，將會對方法開發具有指導意義：另外，目前 ICP-AES 和 ICP-MS 前處理較為復雜且耗時對于難溶性原料藥、藥用輔料和固體制劑通常需加入濃酸或有機溶劑，因此發展靈敏度高、快速無損、綠色環保的分析技術(如x射線熒光光譜法、激光燒蝕-ICP-MS 等)將會是一大重點研究方向，同時有助于實現藥物元素雜質的過程控制和/或現場檢測。
來源：醫藥導報
