摘 要: 嚙齒類動物致癌性試驗是新藥研發中非臨床安全性評價的重要組成部分。致癌性試驗周期較長、數據量大，其統 計學方法選用的合理性、科學性將可能影響試驗結果的結論。首先介紹了目前致癌性試驗常用的生存分析和腫瘤發生率統計方法; 其次，匯總了生存分析和腫瘤發生率統計方法的選用情況; 最后，通過比較申報方、美國食品藥品監督管理局審評方和美國國家毒理學項目中心在統計學方法選用的差異，分析和討論了這些差異的來源和影響，并總結了致癌性試驗統計分析設計思路。希望通過對以上內容的匯總和分析，能夠為新藥非臨床致癌性試驗提供參考。
致癌性試驗的目的是在動物體內中識別某種物質的潛在致癌作用，從而評價人體中的相關風 險，藥物致癌性試驗也是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分。相較于一般毒性試驗而言，致癌性試驗周期較長，試驗內容多，數據量大，而對試驗數據統計分析方法的選擇將直接影響試驗結果的結論。在 1 項致癌性試驗中，會記錄體質量變化、攝食量變化、臨床癥狀、生存狀況、大體解剖觀察結 果、鏡下腫瘤或非腫瘤病變等，而對以上諸多內容 的總結與統計中，生存分析和腫瘤發生率分析是試驗數據結果的核心部分。
美國食品藥品監督管理 局(FDA)的藥品評價與研究中心(CDER)還會對申報上來的致癌性試驗生存分析和腫瘤發生率分析部分進行單獨的統計學審評，可見合理使用統計分析方法是致癌性試驗結果結論科學性的關鍵保證。 基于此，本文將從致癌性試驗各類統計學方法的概念出發，并通過具有代表性的 FDA 統計學審評報告和美國國家毒理學項目中心(NTP)的致癌性試驗統計學方法，剖析嚙齒類動物致癌性試驗統計學方法的使用現狀。
1、 致癌性試驗常用統計學方法
如前文所述，生存分析和腫瘤發生率分析是致癌性試驗數據結果的核心部分。因此，致癌性試驗 常用統計學方法包括生存分析和腫瘤數據統計學分析方法。生存分析模型有 Kaplan-Meier 乘積極限 估計、壽命表和 Cox 比例風險模型。Kaplan-Meier 乘積極限估計(又稱 PL 估計)是致癌性試驗中廣泛 使用的生存分析方法，其依據每個時間點的每個個 體確切的生存狀態來評估各時間點的生存率，根據該方法繪制的 K-M 曲線圖也常被用來直觀地比較 組間生存情況差異，其常用的數據檢驗方法有 Log rank 檢驗、Wilcoxon 檢驗、Tarone 檢驗和 Peto 檢驗。壽命表方法是歷史悠久的 生存分析方法 ，其采用分時間段的方式分析生存變化情，也可以用來繪制生存率曲線圖，但在動物試驗這類可以全 程充分跟蹤生存狀態的試驗中使用率較低，該模型 常用檢驗方法為 Gehan-Breslow 檢驗。Cox 比例風 險模型(又稱 Cox 回歸)是一種半參數模型，能夠兼 容任何生分布的特點使其被廣泛使用，該模型常用檢驗方法是似然比檢驗。
在腫瘤數據統計上，由于腫瘤的發生需要物質暴露時間的積累，生存時間更久的試驗動物比較早 死亡的動物更易罹患腫瘤，所以藥物致癌性試驗腫 瘤發生率數據的分析必須考慮各組動物的生存情 況 ，并 進 行 適 當 調 整。 現 行 的 藥 物 致 癌 性 試 驗 腫 瘤發生率統計分析的指導原則仍是 FDA-CDER 于 2001年發布的行業指南草案《長期嚙齒類動物藥物 致癌性試驗統計學方面的設計、分析和解釋》，該指南認為采用 Peto 分時檢驗或 Poly-k 檢驗可以較為準 確地分析腫瘤發生率。
Peto 分時檢驗需要病理學家對腫瘤是否會導致動物死亡進行分析分類，可 將腫瘤分為偶發性、致死性和不致死(可觀察到)， 然后對以上 3 類腫瘤分別采用患病率法、死亡率法 和發生率法進行腫瘤數據分析。Peto 分時檢驗 理論上能夠很好的調整生存時間對腫瘤發生的影 響，但實踐過程中很受病理專家在病理診斷上主觀性的影響，這也導致該方法引起了廣泛爭議，美國毒性病理學會(STP)也曾發文呼吁探索不需要考慮腫瘤是否致死的替代方法。
Poly-k 檢驗是不需要考慮腫瘤是否致死性腫瘤發生率分析方法，其調整生存對腫瘤發生影響的原理是對未發生腫瘤卻提前死亡的動物個體進行一定的參數加權，以得出1 個該動物若能夠生存到試驗終點所能罹患腫瘤的期望值，這個期望值與 k 值呈負相關，目前普遍認為k=3 是最適合用于嚙齒類動物致癌性試驗的。
FDA-CDER 發 布 的 指 南 中 介 紹 了 Bailer-Portierpoly-3 檢驗和 Bieler-Williams poly-3 檢驗，并認為后者能夠更準確地分析腫瘤發生率結果，Bieler-Williams poly-3 檢驗也是目前選用 Poly-k 方法的普遍選擇。
上述提到的 Peto 分時檢驗和 Poly-k 檢驗方法都 是近似檢驗方法，在各給藥組的腫瘤發生總數較少 時，往往需要使用精確排列法進行檢驗[5]。選用 Peto 分時檢驗的數據仍然可以根據腫瘤與動物死亡 的相關性來選擇相應的精確排列檢驗，而選用 Poly- k 檢驗的數據則只能將發生總數較少的腫瘤全部視為偶發性腫瘤再進行精確排列法進行檢驗。
值得注意的是，來自 FDA 的 Lin 和 Rahman 已 經于 2018 年更新了 P 值閾值，FDA-CDER 審評方已 經不再使用 2001 年指南中的閾值。更新的 P 值閾 值主要在于短期致癌性試驗的調整上，短期致癌性 試驗腫瘤發生率分析顯著性水平從原來的常見腫 瘤 0.01 和罕見腫瘤 0.05 調整為常見腫瘤和罕見腫 瘤均為 0.05，趨勢檢驗和配對檢驗均為此標準。另 外，長期致癌性試驗腫瘤發生率分析顯著性水平仍 是在趨勢檢驗下常見腫瘤 0.005 和罕見腫瘤 0.025， 配對檢驗下常見腫瘤 0.01 和罕見腫瘤 0.05。
2、 FDA-CDER 審評報告中統計學方法
從 2015 年開始，FDA-CDER 將每年獲批的新藥匯總整理出 1 篇年鑒，并在其官網上將這 1 年獲批 的新藥信息一一羅列出來。從2015年到2022年， 共有 360 種新藥被 FDA-CDER 審批通過，通過對這 些獲批的新藥進行篩選，發現有 68 款新藥在公示的 審評文件中均附有致癌性試驗的統計學審評報告。 在這 68 篇統計學審計報告中，共涉及 121 項致癌性 試驗，以下內容即是根據這 121 項致癌性試驗統計 學審評報告的統計匯總
2.1 申報方生存分析方法
所有的 121 項試驗都使用了 Kaplan-Meier 乘積極限估計，并出示了K-M生存曲線圖。有23項試驗在方法描述中提到其使用了壽命表(life table)，有 14 項試驗在方法描述中提到其使用了 Cox 比例風險模型。在生存數據檢驗方法的選擇上，有 100 項試驗選擇了根據 Kaplan-Meier 乘積極限估計數據的檢驗方法，并有 96 項試驗選擇了完全根據 Kaplan-Meier 乘積極限估計數據的檢驗方法。其中，有 94 項試驗 提到了其使用了 Log rank 檢驗，并有 46 項試驗只使 用了 Log rank 檢驗這 1 種試驗方法;有 41 項試驗提到了其使用了 Wilcoxon 檢驗，并有 6 項試驗只使用了Wilcoxon檢驗這種試驗方法;有8項試驗提到了其使用了 Peto 檢驗;有 8 項試驗提到了其使用了 Tarone 檢驗。有 12 項試驗選擇了根據壽命表數據的檢驗方法，其中有10項試驗提到了其使用了 Gehan-Breslow 檢驗，有 2 項試驗未注明使用了何種檢驗方法。
有 14 項試驗提到其使用了 Cox 比例風險模型或 Cox 回歸分析，但均未注明使用了何種檢 驗方法。有6項試驗提到其使用了非生存分析類檢 驗方法，包括 Fisher 精確檢驗和 Kruskal-Wallis 非參 數檢驗(基于生存天數或周數)，并有4項試驗僅使 用了非生存分析類檢驗方法進行試驗。另外，有 5 項試驗未注明使用了何種檢驗方法。在生存分析檢驗方式和方法的選擇上，有 119項試驗使用了配對檢驗，其中有54項僅使用Logrank 檢驗方法、有 14 項僅使用 Wilcoxon 檢驗方法、有 10 項僅使用壽命表分析中 Gehan-Breslow 檢驗方法、有 6 項僅使用 Peto 檢驗方法、有 22 項同時使用Log rank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗、有 1 項同時使用Peto 檢驗、Log rank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗、有 1 項同時使用 Peto 檢驗和 Log rank 檢驗、有 4 項使用非生存分析類檢驗方法、有7項未注明使用的檢驗方法有 79 項試驗使用了趨勢檢驗，其中有 27 項僅使用Logrank檢驗方法、有10項使用壽命表分析中Gehan-Breslow檢驗方法、有9項僅使用Tarone檢驗方法、有 1 項僅使用 Peto 檢驗方法、有 24 項同時使用 Log rank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗、有 1 項同時使用Tarone 檢驗、Log rank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗、有 7 項未注明使用的檢驗方法;有59項試驗使用了總體檢驗，其中有 34 項僅使用 Log rank 檢驗方法、有 16 項僅使用 Wilcoxon 檢驗方法、有 6 項同時使用 Logrank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗、有 3 項未注明使用的檢 驗方法。
在不考慮最優先進行的雙對照組檢驗的情況 下，有 55 項試驗在描述中提到了其生存分析部分采用了一定次序的分析程序，其中有 45 項先開始總體 檢驗，確定總體檢驗存在顯著性差異后再進行后續 的趨勢或配對檢驗;有 10 項先開始趨勢檢驗，確定 存在顯著性差異后，再從高劑量組到低劑量組逐個 與陰性對照組比較。
2.2 申報方腫瘤數據統計學方法
在指導原則推薦的 Peto 分時檢驗模型和 Poly-3 檢驗方法的選擇使用上，有 108 項試驗使用了 Peto 分時檢驗模型;有 7 項試驗使用了 Poly-3 檢驗方法; 有 2 項試驗同時使用了 Peto 分時檢驗模型和 Poly-3 檢驗方法;僅有4項試驗既未使用Peto分時檢驗，又 未使用 Poly-3 檢驗方法，且這 4 項試驗全部是 6 個月轉基因小鼠致癌性試驗。
共有23項試驗使用了除Peto分時檢驗和Poly- 3 檢驗之外的檢驗方法，包括 Cochran-Amitage 趨勢 檢驗、Fisher 精確配對檢驗方法和生存分析方法。 其中的 19 項試驗是將這類檢驗方法作為 Peto 分時 檢驗的補充，如利用Fisher精確配對檢驗進行陽性 對照組和陰性對照組的比較、使用生存分析方法對 可觸及且實時追蹤的腫瘤進行更精確的分析檢驗等。
部分試驗的統計學描述中，提到了使用精確版本 Peto 檢驗或 Poly-3 檢驗的條件。在這些試驗中， 大部分將腫瘤發生個數少于等于10個作為使用精 確版本 Peto 檢驗的條件。
2.3審評方統計學方法
2015-2022年這8年來，FDA-CDER的審評方在致癌性試驗統計學審評報告中使用的統計學方法基本不變，以下是審評方使用的生存分析方法和腫瘤分析方法的總結。在生存分析方法上，審評方使用了Kaplan-Meier乘積極限法分析生存數據，并繪制 Kaplan-Meier 生存曲線圖。在生存分布的總體檢驗上，使用Log- Rank檢驗;在劑量反應關系，即趨勢檢驗上，使用 Cox 比例風險模型中的似然比檢驗;在給藥組與陰 性對照組的配對檢驗上，則使用似然比檢驗和 Log- Rank 檢驗 2 種方式。以上生存分析數據和圖表均 會被出示在審評報告中。在腫瘤數據分析方法上，審評方使用 Poly-3 方法進行腫瘤數據分析[13-20]。當某一腫瘤類型的帶瘤動物少于 10 只，則采用精確檢驗方法，否則采用漸 近檢驗方法。在統計學意義判定上，審評方根據 FDA 在 2001年發布的指南和 Lin 等的補充規則對 2 年期致癌性試驗和6月期轉基因小鼠致癌性試驗采用了不 同的統計學意義水平。
對于 2 年期大小鼠致癌性試 驗，審評員在趨勢檢驗中對常見腫瘤和罕見腫瘤分 別采用 0.005 和 0.025 的顯著性水平;在配對比較重 對常見腫瘤和罕見腫瘤分別采用 0.01 和 0.05 的顯 著性水平。對于 6 個月轉基因小鼠致癌性試驗，審 評員在趨勢檢驗和配對比較上對常見腫瘤和罕見 腫瘤均采用 0.05 的顯著性水平。罕見腫瘤的判定 標準是腫瘤自發率低于 1% 的腫瘤，反之為常見 腫瘤。
3、 NTP 致癌性試驗報告中的統計學方法
美國國家毒理學項目中心(NTP)是美國衛生與公眾服務部下的一個跨機構項目，旨在提供環境中 潛在有害物質的毒理學信息[21]。NTP自1978年成 立以來，已經評估了 2 800 余種環境物質對人類健 康的潛在影響[21]，其致癌性評價項目也為美國衛生與公共服務部發布致癌物報告提供了研究支撐[22]。 NTP 的毒性和致癌性研究有一套較為固定的統計 分析程序，本部分的統計學方法是根據 NTP 公示的 統計分析程序和 2018—2021 年較有代表性的 4 篇 致癌性研究報告(TR-601、TR-600、TR-599、TR-594) 進行的總結。
在生存分析方法上，NTP使用Kaplan-Meier乘 積極限法分析生存數據，并繪制 Kaplan-Meier 生存 曲線圖。對于無妊娠的大、小鼠試驗，使用 Tarone 壽命表檢驗做生存檢驗趨勢分析，使用Cox比例風 險模型用于暴露組與對照組的成對比較[11，23-26]。對 于從圍產期開始的大鼠 2 年期試驗，對斷奶后的 F1 代大鼠使用 Cox 比例風險模型分別進行生存檢驗趨 勢分析和暴露組與對照組的成對比較。在腫瘤與非腫瘤病變發生率分析上，對于常規2 年大、小鼠試驗，NTP 使用 Poly-3 檢驗進行腫瘤與非腫瘤病變發生率分析。對于從圍產期開始的大鼠 2 年致癌性試驗，對 F1 代大鼠使用經過 Rao-Scott調整的Poly-3檢驗進行分析，其考慮了同窩相關性。
在連續變量分析上，NTP 首先用 Jonckheere 檢 驗驗證變量與暴露量是否有趨勢相關性，若有趨勢 相關性則采用趨勢檢驗，若沒有趨勢相關性則采用 成對比較。對于器官質量、體質量等具有近 似正態分布的數據，采用參數檢驗方法，包括 Dunnett成對比較或Williams趨勢檢驗;對于血液 學、尿液分析等具有偏態分布的數據，采用非參數 檢驗方法，包括Dunn成對比較或Shirley趨勢檢驗。
對于從圍產期開始的大鼠2年期致癌性試驗，要根據窩組效應，對以上檢驗方法進行相應調整。
4、 結語
申報方、FDA 審評方和 NTP 在生存情況分析與腫瘤數據分析上的統計學方法使用上有著一定差 異。在生存分析方法方面，Kaplan-Meier 乘積極限 估計方法是幾乎所有致癌性試驗生存分析都會用 到的;Cox 比例風險模型被 FDA 審評方和 NTP 大量 使用，但申報方很少使用此方法;壽命表方法則僅 被 NTP 大量使用以進行趨勢檢驗分析，申報方很少使用此方法，FDA 審評方不使用該方法。
在數據檢驗方法上，申報方大多使用 Log Rank 檢驗和 Wilcoxon 檢驗，FDA 審評方使用 Log Rank 檢驗和 Cox 比例風險模型、NTP 使用 Tarone 壽命表檢驗和Cox 比例風險模型。由于沒有相關指導原則或相關 指南的建議或推薦，申報方在生存分析方法和數據 檢驗方法上的使用都較為繁雜，不過主流上基本都 會選擇繪制 K-M 曲線并使用 Log-Rank 檢驗進行總體、趨勢和配對檢驗。與申報方的主流生存分析方法相比，FDA 審評方還會使用 Cox 比例風險模型進 行劑量趨勢檢驗和各劑量組間的配對比較。
在腫瘤數據分析方法上，Peto 分時檢驗仍是申 報方最常使用的方法，而FDA審評方和NTP則使用 Poly-3 檢驗。如前面所述，使用 Peto 分時檢驗需要 病理學家將腫瘤分類為致死性、偶發性和不致 死(可觀察到)，并對這3類腫瘤分別采用患病率法、 死亡率法和發生率法進行腫瘤數據分析，這是最直 接地能夠調整生存對腫瘤發生的影響的檢驗方法， 而 Poly-3 檢驗只是為終末期前死亡的動物分配風險 權重的一種調整生存率影響的方法。因此有學者認為，如果條件允許，則有必要采用 Peto 分時檢 驗，這可能是 FDA 申辦方考慮更多使用 Peto 分 時檢驗的原因。而 FDA 審評方無法就每只動物的 病理切片進行病理判斷，只能根據申報方提供的腫 瘤發生數據使用更為標準化的Poly-3檢驗。
NTP在 統計分析程序中未解釋其為何未使用 Peto 分時檢 驗，但其中描述了在 1988 年 Bailer 和 Portier 發表的 論文中，使用 Poly-k 方法評估了 1986 年 Portier 等人 發表的 NTP 致癌性試驗中對照組 F344 大鼠和 B6C3F1 小鼠中各種特定部位的病變，并建議 k=3 的值，這可能是目前NTP使用Poly-3檢驗進行腫瘤 數據分析的開端。根據NTP發布的統計分析程 序，目前NTP已經使用了1993年經過調整的Bieler- Williams Poly-3檢驗方法。
根據以上的匯總與討論，推薦致癌性試驗的統計分析可按照以下思路進行設計。在生存分析上， 首先使用 Kaplan-Meier 乘積極限估計方法，并選用 該模型的一種檢驗方法(如Log Rank檢驗)對生存 數據依次進行總體檢驗、趨勢檢驗和配對檢驗，并 最好再使用 Cox 比例風險模型對生存數據進行趨勢 分析和成對比較。在腫瘤發生率分析上，在有足夠專業的病理學家以判斷腫瘤是否致死的情況下，推薦使用 Peto 分時檢驗，否則推薦使用 Bieler- Williams Poly-3檢驗。
本文匯總了申報方、FDA 審評方和 NTP 在致癌性試驗中統計學方法的使用，分析和討論了三者在 生存分析方法和腫瘤發生率分析方法的選用差異， 并就此總結了致癌性試驗統計分析設計思路。希望通過本文的介紹與匯總，能夠為新藥非臨床致癌性試驗研究提供一定參考。
