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嘉峪檢測網 2024-12-05 09:04
SDS-PAGE電泳是蛋白質分離純化中最常用的技術之一，但實驗過程中，我們常常會遇到各種各樣的問題。下面總結了一些常見的SDS-PAGE電泳問題以及相應的解決方法，希望對你有幫助！
在了解相關問題之前，我們首先要搞清楚SDS-PAGE電泳是怎么工作的？
想象一下，我們有一堆不同大小的豆子，想把它們按照大小排隊。而SDS-PAGE電泳就是蛋白質的“篩子”，它能把不同大小的蛋白質按照“身高”（分子量）排成一隊。
SDS
SDS是一種特殊的化學試劑，它可以包裹住蛋白質，讓所有的蛋白質都帶上負電荷。這樣，在電場的作用下，所有的蛋白質都能夠向正極移動。
凝膠
凝膠就像一個布滿小孔的海綿，不同的孔大小不一，作用類似于蛋白質的“跑道” 。蛋白質在電場的作用下，就像參加比賽一樣，從凝膠的一端往另一端跑。大的蛋白質跑得慢，小的蛋白質跑得快。最后，它們就會按照大小排成一個梯度。
（圖片來源：https://gyansanchay.csjmu.ac.in/wp-content/uploads/2022/10/SDS-PAGE.pdf）
常見問題及解答
1、分離膠濃度的選擇
在SDS-PAGE電泳中，分離膠濃度是一個至關重要的參數，直接影響著蛋白質的分離效果。濃度越高，孔徑越小，越適合分離小分子蛋白質；濃度越低，孔徑越大，越適合分離大分子蛋白質。以下是我們總結的一個常見凝膠溶液濃度與蛋白質分子量范圍的對應關系表：（僅供參考）
2、凝膠凝結的太慢或不凝固
SDS-PAGE凝膠的凝固時間一般在30分鐘～1小時之間。如果凝固速度過慢，很可能是因為引發聚合反應的兩種試劑——TEMED和APS出了問題。TEMED和APS的用量不足或者失效都會導致凝膠凝固緩慢。
其中，APS（過硫酸銨）非常不穩定，容易分解失效，所以每次使用前都需要現配。而TEMED也比較敏感，容易被氧化變黃，失去活性。
解決方法：
檢查并調整引發劑用量，確保TEMED和APS用量準確，并按比例混合。
保證APS現配現用，避免長時間暴露在空氣中。
TEMED要注意避光保存，并置于4℃冰箱中。
3、條帶拖尾和彌散
可能的原因：
樣品降解：蛋白質在制備過程中發生降解，導致分子量變小，條帶彌散。
樣品過載：上樣量過多，導致條帶重疊，分辨率降低。
樣品緩沖液配制錯誤：緩沖液的pH值或離子強度不合適，影響蛋白質的遷移。
樣品溶解不充分：蛋白質沒有完全溶解，導致部分蛋白質沒有進入凝膠。
解決方案：
延長變性時間：確保蛋白質充分變性，一般在95-100℃加熱5～10分鐘。
減少上樣量：逐步減少上樣量，直到條帶清晰為止。
更換緩沖液：如果緩沖液使用時間過長，需要更換新鮮的緩沖液。
4、“微笑”型條帶（條帶兩邊翹起，中間凹下）
這種現象通常可能是由于以下幾個原因造成，需要逐一排查。
凝膠凝固不均勻
在較厚的凝膠中，凝膠的中間部分凝固的不均勻。建議待凝膠充分凝固后再進行后續實驗。
電流過大
電流過大可能導致凝膠局部過熱，從而引起條帶彎曲。可以適當降低電泳電壓，減少電流，或使用恒流電源，確保電流穩定。
電泳時間過長
電泳時間過長也可能導致凝膠過熱，引起條帶彎曲。可以適當縮短電泳時間，并觀察溴酚藍指示劑的位置，當其到達凝膠底部時停止電泳。
玻璃板未夾緊
檢查玻璃板之間的密封性，確保沒有漏液現象。
上樣不均勻
樣品在上樣時分布不均，也可能導致條帶彎曲。建議使用微量移液器緩慢、均勻地將樣品加入樣品孔中。
5、“皺眉”型條帶（條帶兩邊向下，中間鼓起）
出現這種現象通常可能是由于以下幾個原因造成：
樣品不均一或上樣量過多：
樣品中含有不溶性顆粒或高濃度鹽，導致樣品在孔中沉淀，影響電泳遷移。上樣量過大導致樣品孔中的蛋白質濃度過高，中間部分的蛋白質遷移受到阻礙。建議充分溶解樣品，去除不溶性物質，控制上樣量，避免過載。
電泳條件不穩定：
電壓波動、電流不穩定等因素都會影響蛋白質的遷移。
玻璃板：
玻璃板上有殘留的雜質，影響了樣品的遷移。也有可能是兩塊玻璃板之間的底部間隙氣泡沒有排盡，阻礙電場均勻分布，影響樣品遷移。
來源：實驗老司機
