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嘉峪檢測網 2024-10-23 08:18
DNA提取的目的是從細胞或組織中分離并純化DNA。通常包括細胞裂解、去除蛋白質和其他雜質、以及DNA的沉淀和純化。
一、離心柱法提取DNA步驟
1）將組織或細胞懸液加入裂解緩沖液，渦旋混勻。裂解緩沖液中含有變性劑（如胍異硫氰酸鹽），可以有效地裂解細胞和組織，破壞細胞膜和細胞核膜，同時使核酸與蛋白質分離。
2）將裂解液轉移到DNA Spin Column中，離心收集流穿液。這個步驟涉及到將裂解液通過一個特殊的膜過濾，該膜具有特定的孔徑，允許小分子如RNA和蛋白質通過，而DNA由于其較大的分子尺寸被截留在膜上。
3）用Washing Buffer洗滌DNA柱膜。Washing buffer中含有乙醇和鹽，可以去除雜質和蛋白質，保留DNA在柱膜上。
4）將Elution Buffer加入到柱中，離心收集純化的DNA。Elution Buffer是低鹽緩沖液，能有效洗脫柱膜上結合的DNA，得到純化的基因組DNA。因為DNA在低鹽條件下更容易溶解。離心后，收集純化的DNA到一個新的收集管中。
5）提取完成后，使用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，通過測定260nm和280nm的吸光度比值來評估DNA的質量和蛋白質污染情況。
6）純化的DNA應妥善存儲于-20°C或更低的溫度下，以保持其穩定性和防止降解。
二、根據目標基因序列設計PCR引物
在成功提取并純化了目標基因的DNA后，下一步是設計PCR引物，以便進行目標基因的擴增。合理設計的引物可以確保PCR反應的特異性和效率。設計PCR引物時需考慮以下原則：
1）引物的長度為18-25bp，引物過短可能導致非特異性結合，引物過長可能導致退火效率低。
2）理想的GC含量在45%-55%之間。
3）避免引物內部和引物之間形成二級結構（如發夾結構）和二聚體。
4）引物的3'端應避免過多的G或C，因為這可能導致非特異性擴增。
5）對于基因組DNA，引物不應設計在跨越內含子的區域，以避免擴增非編碼區域。
6）引物的3'端不應有過多的連續相同堿基，以減少3'端退化現象。
三、電泳鑒定
1）使用PCR擴增特定的DNA片段。PCR體系：10μL SYBR+ 0.5μL Forward Primer+0.5 μL Reverse Primer+ 1μL 模版DNA+8μL DEPC
2）稱取0.3g瓊脂糖，加入30mL TAE緩沖液。攪拌均勻后，用錫紙封口。將錐形瓶放入微波爐加熱30秒，直至瓊脂糖完全溶解，呈現透明無顆粒狀態。待溶液冷卻至45℃，加入1.5µL核酸染料，輕輕混勻。
3）將溶液倒入提前洗凈晾干的制膠板中，厚度為0.3-0.5cm。插入制膠梳，確保膠中無氣泡，靜置30分鐘待膠凝固，小心拔掉梳子。瓊脂糖凝膠用于分離不同大小的DNA片段。TAE緩沖液維持電泳過程中適當的pH和離子強度。核酸染料如溴化乙錠嵌入DNA分子中，使其在紫外光下發光，從而可以顯影DNA條帶。
4）將凝膠連同膠托放入電泳槽正中央，有膠孔的一側朝向負極。在電泳槽中倒入TAE緩沖液，剛好淹沒凝膠。在10µL樣品中加入2µL loading buffer，混合后加入膠孔中，加入5µL marker。Loading buffer含有溴酚藍和二甲苯氰，作為電泳指示劑，顯示電泳進程，便于適時終止。甘油增加樣品密度，使樣品沉降到點樣孔中。
5）蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設置電壓100V-150V，運行30分鐘-1小時。電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像系統拍攝。在電場作用下，帶負電荷的DNA分子從負極向正極遷移。較小的DNA片段遷移得更遠。
6）電泳結束后，使用紫外光源觀察染料標記的DNA條帶，并通過凝膠成像系統拍攝記錄結果。
四、實驗結果展示
上述是筆者自己做的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，左側是Marker（100bp-1500bp），右側是條帶的位置反映了DNA片段的大小。較小的DNA片段移動距離較大，位于下部；較大的DNA片段移動距離較小，位于上部。條帶清晰、明確，表明DNA樣品純度高。如果有拖尾或彌散條帶，可能表明DNA降解或樣品中含有雜質。
五、注意事項
1）在處理多個樣本時，使用單獨的離心管和離心柱，避免樣本之間的交叉污染。
2）設置合適的電壓，過高的電壓可能導致凝膠過熱或DNA條帶扭曲。
3）在電泳過程中和電泳結束后，避免凝膠干燥，這會影響DNA條帶的清晰度。
來源：實驗老司機
