天堂网www,免费追剧大全在线观看电视剧,97久久精品无码一区二区欧美人 ,日本丰满少妇高潮呻吟

 

一、用途：

            藥物篩選、

            細胞增殖測定、

            細胞毒性測定、

            腫瘤藥敏試驗等。

 

二、優點：

· 使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；

 

· CCK-8法能快速檢測；

 

· CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；

 

· CCK-8法的重復性優于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；

 

· 而本方法產生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

 

· CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

 

· CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

 

三、所需設備及儀器：

1. 10ul，100-200ul及多通道移液器

2. 酶標儀（帶有450nm濾光片）

3. 96孔培養板

4. 二氧化碳培養箱

四、方法及步驟：

 

實驗一：細胞增殖分析

1、制備細胞懸液：細胞計數。

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約1-2×10⁴），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。

 

3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基（現用現配），以換液的形式加入。

5、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件（建議預實驗先摸清楚時間點）。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

 

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析

1、制備細胞懸液：細胞計數

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約≥5×10⁴），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復。

 

3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

 

4、加入不同濃度的毒性物質。

 

5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間（例如：6、12、24、48、60、72小時）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

7、培養0.5-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

 

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

 

五、實驗注意事項：

 

· 若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。

 

· 如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

 

· 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。

 

· 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

 

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。

 

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

 

· 當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。

 

· 在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

 

· 金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

 

· 懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。

 

· 加入CCK-8 時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

 

·  用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。