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嘉峪檢測網 2022-09-01 20:40
本文主要介紹了上海捷諾生物科技有限公司研發的醫療器械“人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）”的臨床前研發實驗。
一、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法） 的產品結構及組成
表 1 試劑盒主要組成成分
二、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）產品預期用途
本產品用于體外定性檢測人宮頸脫落細胞中 ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671 基因的甲基化狀態。
本產品適用于 12 種高危 HPV（hrHPV）基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型）檢測陽性的 30 歲以上女性人群，幫助識別是否需要進行陰道鏡檢查，達到分流管理的目的。hrHPV 持續感染是導致宮頸癌的主要病因，但大多數感染是一過性且無臨床癥狀，能夠通過自身免疫系統調節而清除，僅有極少數 hrHPV 持續感染的患者可能會進展為宮頸癌前病變甚至宮頸癌。
使用本產品檢測，當檢測結果為陰性時，提示無宮頸病變或宮頸病變級別較低的可能性較大，可避免陰道鏡及組織活檢檢查，做好定期復查；檢測結果為陽性時，提示宮頸病變級別較高的可能性大，需進一步進行陰道鏡和/或組織活檢檢查。該檢測不能替代宮頸細胞學檢查。
三、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產品包裝規格
10 人份/盒。
四、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產品檢驗原理
本產品包括三個步驟：細胞裂解、亞硫酸氫鹽轉化和實時熒光PCR。
步驟 1，細胞裂解：使用試劑盒內的裂解液對宮頸脫落細胞進行裂解，釋放基因組 DNA；
步驟 2，亞硫酸氫鹽轉化：細胞裂解后用亞硫酸氫鹽進行轉化處理，DNA 上未發生甲基化的胞嘧啶 C 因脫氨基反應變成尿嘧啶 U，而發生甲基化的胞嘧啶 C 則不會被亞硫酸氫鹽轉化；
步驟 3，實時熒光 PCR：以轉化后的 DNA 為模板做熒光 PCR擴增，特異性的引物只能擴增發生甲基化的基因，從而檢測 6 個基因 ASTN1（Marker1）、DLX1（Marker2）、ITGA4（Marker3）、RXFP3（Marker4）、SOX17（Marker5）、ZNF671（Marker6）的甲基化狀態。
本產品同時設置了內部質控 Marker QC 和 Marker QM，Marker QC 用于評估樣本 DNA 是否足量以及亞硫酸氫鹽轉化質量是否合格，Marker QM 用于評估女性樣本的正常甲基化狀態。
五、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）主要原材料的選擇
本產品的主要原材料包括：產品的主要原材料有引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Eva Green 染料、SiHa 細胞和裂解液。這些原材料均是通過外購的方式獲得。
引物由上海捷諾自行設計，由合成公司經過合成和純化后獲得；Taq DNA 聚合酶由原材料供應商重組表達純化后獲得；dNTPs 由供應商化學合成獲得。
上海捷諾對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。
六、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的企業參考品設置情況
該產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、最低檢出限參考品，組成如下：
陽性參考品包括 7 種，分別命名為陽性參考品 P1~P7，其中陽性參考品 P1~P3 為一定細胞量下不同甲基化比率的樣本；陽性參考品 P4~P5 為不同濃度的 SiHa 細胞；陽性參考品 P6 為人宮頸鱗癌細胞樣本；陽性參考品 P7 為人宮頸腺癌細胞樣本。
陰性參考品包括 5 種，分別命名為陰性參考品 N1~N5，其中陰性參考品 N1 為 IL-17 基因甲基化的人宮頸脫落細胞；N2 為 STK31基因甲基化的人宮頸脫落細胞；N3 為 DNMT1 基因甲基化的人宮頸脫落細胞；N4 為 IFFO1 基因甲基化的人宮頸脫落細胞；N5 為卵巢癌患者的宮頸脫落細胞。
精密度參考品包括 3 種，分別命名為精密度參考品 C1~C3，其中精密度參考品 C1 為中高甲基化比率的樣本；精密度參考品 C2 為低甲基化比率樣本；精密度參考品 C3 為 6 個標志物非甲基化的人宮頸脫落細胞樣本。
最低檢出限參考品包括 6 種，分別命名為最低檢出限參考品S1~S6，為經過系列稀釋后的 6 個不同甲基化比率的細胞樣本。
本試劑盒設置了陽性質控和陰性質控，用于檢測過程中試劑盒和儀器的質量控制。此外，每個樣本均檢測 2 個內部質控，用于結果的判讀和評估樣本的質量。
七、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的生產工藝及反應體系研究
上海捷諾對試劑盒反應體系的研究包括引物濃度的確定、PCR 反應液的選擇、反應體積的確定、亞硫酸氫鹽轉化試劑盒的確定等；對PCR 反應條件的研究包括兩步法與三步法、退火溫度和擴增循環數的優化；對樣本的用量以及樣本保存時間進行了研究；對基線和閾值的確定。
通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。上海捷諾根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。
八、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的分析性能評估研究
該產品分析性能評估內容包括準確度、精密度、最低檢出限、分析特異性、包容性、亞硫酸氫鹽轉化試劑盒研究。準確度研究中，上海捷諾分別使用三批次試劑盒對陽性參品和陰性參考品進行檢測，檢測結果顯示陽性參考品符合率、陰性參考品符合率均為 100%。同時使用若干臨床樣本對試劑盒準確性進行了研究，檢測結果與臨床金標準診斷方法學（病理學）結果進行比對，得出 CIN2+和 CIN3+的臨床靈敏度分別是 83.05%和 89.47%，臨床特異性分別是 84.55%和 78.44%。
精密度研究通過不同地點、人員、輪次、日間和批次對中強陽性、弱陽性以及陰性樣本進行連續 20 天精密度研究，本試劑盒檢測結果的 Ct 值變異系數（CV）均不大于 5.0%。最低檢出限研究，以陰性宮頸脫落細胞樣本為基質，對不同甲
基化比率的模擬樣本和臨床陽性稀釋樣本進行檢測，得到宮頸脫落細胞樣本的檢測限，6 個基因的最低檢出限如下表：
分析特異性研究包含交叉反應和干擾研究，交叉反應研究結果表明試劑盒檢測非目標的其他基因甲基化陽性的宮頸脫落細胞樣本，均無交叉反應。
干擾實驗研究結果顯示，宮頸脫落細胞樣本中含有以下干擾物質：500mg/dL 血紅蛋白、1×106個/mL 白細胞、宮頸粘液、20mg/mL替硝唑陰道片、174mg/mL 保婦康栓、100mg/mL 重組干擾素 α2b 凝膠、潤滑劑，對本試劑盒的檢測結果無影響。
包容性研究，上海捷諾對不同宮頸癌組織類型樣本的適用性進行研究，對宮頸癌組織類型為鱗癌、腺癌、腺鱗癌樣本研究結果表明，本試劑盒適用于不同宮頸癌組織類型。
上海捷諾采用臨床宮頸脫落細胞樣本進行了亞硫酸氫鹽轉化試劑盒性能研究，并根據與本試劑盒的組合性能研究結果，確定推薦的亞硫酸氫鹽轉化試劑盒符合檢測要求。
九、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的陽性判斷值或參考區間研究
本產品陽性判斷值的研究采用臨床來源的宮頸脫落細胞樣本。
636 例樣本中≤CIN1 病例 503 例，CIN2 病例 85 例，≥CIN3 病例48 例。上海捷諾使用本產品和一代測序分別檢測上述樣本中 6 個基因的甲基化情況，以一代測序結果為金標準，采用 ROC 曲線法確定每個基因 ΔCt 值的陽性判斷值。
以病理結果為金標準，采用邏輯回歸分析方法確定模型中 6 個基因的權重，建立 6 個基因的評分，然后根據約登指數最大的原則確定最佳閾值，最終確定本試劑盒的陽性判斷值為 3。當 6 個基因分值總和＜3 時，樣本檢測結果為陰性；當 6 個基因分值總和≥3 時，樣本檢測結果為陽性。
十、人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、 ZNF671 基因甲基化檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的穩定性研究
上海捷諾對本產品的實時穩定性、運輸穩定性進行了研究，同時，對樣本的穩定性也進行了研究。
實時穩定性：將三批次試劑盒置于 2～8℃條件下保存，在效期的第 0、8、10、12、14 個月各進行一次檢測，試劑盒在生產后保存至 14 個月各項性能指標均符合產品技術要求，產品有效期可達 12個月。
此外，上海捷諾對產品的運輸穩定性進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書的聲稱。
樣本穩定性：上海捷諾對樣本穩定性進行了研究，結果表明樣本在室溫下保存 4 周內，在 2～8℃保存 12 周內進行檢測。常溫條件下，樣本運輸時間不超過 3 天。
來源：嘉峪檢測網
