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嘉峪檢測網 2018-12-04 17:22
蛋白定量最常用的兩種方法BCA法、Bradford（考馬斯亮藍）法。
現將其原理與實驗選擇中略微差別簡介如下
原理
BCA法原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，吸光強度與蛋白濃度成正比。測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。
Bradford法原理：考馬斯亮藍在酸性游離狀態下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變為藍色，最大光吸收在595nm。在一定的濃度范圍內，蛋白質-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。蛋白質和考馬斯亮藍結合，在2-5min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1小時內保持穩定。
選擇區別
BCA法：該方法可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。但該方法受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。
Bradford法：該方法樣品中β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)的濃度可高達1M，二硫蘇糖醇(DTT)的濃度可高達5mM。但該方法受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。
來源：AnyTesting
