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嘉峪檢測網 2020-10-19 11:49
原料藥的粒徑及粒徑分布對制劑的加工性能、穩定性和生物利用度等有重要影響。本文總結了粒徑表征的基本概念，及常見測量手段（篩分、激光散射、圖像法和沉降法）的原理、優劣和注意事項。
1、粒徑的表征方式
對于球形物體，通過直徑很容易確定其大小；但對于立方體，則需要更多的參數，如長寬高；而對于形狀更為復雜的顆粒體，恐怕沒有足夠的參數準確描述其大小。但在實際應用中，只要能夠描述其相對大小，指導意義就很大了。為了采用簡單的參數直觀描述顆粒的大小，往往采取等效球體的直徑來描述顆粒的大小。這種等效的基礎常常是表面積、體積或者投影面積，分別被稱為表面積徑、體積徑或投影徑等。此外，還可以等效為具有相同沉降速度的球形粒子，稱為斯托克徑。我們通過各種檢測方法獲得的測量值一般都是理論等效值。不同原理的粒度檢測設備的使用的等效物理參量不同，在檢測同一個不規則顆粒時，得到的測試結果是不相同的，因此將不同測試方法的結果進行比較，可能無法得出具有實際意義的結論。
粉體作為一堆粒子的集合，不同的粒子顆粒大小可能不同，表示粉體粒徑的大小可以采用平均粒徑。計算每一個顆粒的某一等效粒徑，然后采用粒子數目、長度、表面積或粒子體積等參數作為權重計算平均粒徑，從而得到不同的平均等效粒徑。其中在藥學中較為重要的平均徑包括表面積加權平均粒徑（該值與表面積成負相關）和體積加權平均粒徑。
平均粒徑無法描述各個顆粒的粒徑情況。當就某一粒徑范圍的粒子數或粒子重量對粒徑范圍或平均粒徑作圖，就得到所謂的頻率分布曲線，其可以直觀的表示粒徑分布。另一種表示分布的方式是將超過或低于某一粒徑的累積百分數對粒徑作圖，得到的曲線往往為S形。在實踐中，粒徑分布對API性質的影響可能超過平均粒徑，應當給以充分的重視。
2、粒徑及粒徑分布的測量
粒徑及其分布的測定基于不同的原理有多種測定方法。在中國藥典和日本藥典中描述了顯微法（即本文的“圖像法”）、篩分法和激光散射法。美國藥典也對對篩分和激光散射法進行了描述。除上述三種藥典方法外，沉降法也可用于粒徑的表征。下面就對這些方法的特點和注意事項進行介紹。
（1）篩分
最簡單衡量粒徑的方法，就是其是否能夠通過某一直徑的孔，這就是所謂的“過篩”。篩網大小的單位稱為“目”，表示每英寸孔眼數目。在篩網的目數前加正負號則表示能否漏過該目數的網孔，負數表示能漏過該目數的網孔，即顆粒尺寸小于網孔尺寸；而正數表示不能漏過該目數的網孔，即顆粒尺寸大于網孔尺寸。采用篩網作為工具進行粒徑表征，其孔徑大小必然是重要參數。但很遺憾的是，對于篩網孔徑的大小未能形成統一標準，不同國家有不同的標準。常見的標準下的篩網編號和孔徑大小見表1。
表1. 標準篩孔徑大小
選擇一系列不同篩孔直徑的標準篩， 按照孔徑從小到大依次摞起，在最大孔徑的篩網中加入樣品，震動篩網，通常是由于重力的作用，顆粒中不同粒徑范圍的粒子會分布在不同的篩網中，測定各個篩網中顆粒的含量，從而得到粒徑分布。對于篩分法測定粒徑分布，中國藥典、美國藥典和日本藥典都做了較為詳盡的描述。
篩分原理簡單、直觀，操作方便，易于實現。但是正是由于其簡單性，其在樣品用量、準確度和重復性等方面也有較大的缺點。一般而言，篩分法的物料用量為25g~100g，物料用量相對較大；由于篩網本身的區分力有限，一般僅適用于粒徑大于75μm（粉體中80%的粒子的粒徑大于75μm）的顆粒；篩分測量的精度受制于篩網劃分的層數，同時極易受到顆粒形狀、靜電、測試條件、測試環境等因素的影響，從而造成較大的誤差，因此需要特別注意觀察篩分過程中的現象，如顆粒是否吸潮，顆粒是否在震蕩過程中聚集，篩網在震蕩過程中是否被堵塞等，并針對性解決這些問題，可以有效提高試驗的準確度；此外，采用符合相關標準、性能穩定的機械設備，對保證測量的重復性也有重要幫助；最后，值得特別注意的一點是關于篩網本身的精度問題。由于廠家制造能力或篩網的制造原理的不同等因素，不同的篩網可能本身就存在差距；使用時間過長或者不當使用等原因也可能造成篩網精度的下降。不同的篩網可能與其標識的目數有差距，或者孔徑的均一性已經達不到使用要求，從而造成篩分的準確度下降。擬將篩分作為質控手段時，應當特別注意對篩網的校驗。最后，應特別注意測量的重復性，中國藥典做出了較為具體的規定，即“連續兩次篩分，各個藥篩上遺留的顆粒及粉末重量的差異不超過前次遺留顆粒及粉末重量的5%或兩次重量的差值不大于0.1g；若某一藥篩上遺留顆粒及粉末的重量小于供試品取樣量的5%，則該藥篩連續兩次的重量差異應不超過20%”。
篩分除了作為一種測試手段，本身也可以作為一種粒徑控制手段。例如在制粒后獲取某一粒徑范圍內的粒子，用于后續工藝或質量研究，從而更清楚地獲取粒徑和后續結果的相關性。對于越來越追求API微粉化甚至納米化的今天，篩分在API粒徑分布的測量中的應用可能會受到更多限制，但在大顆粒的粒度控制和表征方面仍有不可替代的作用。
（2）激光散射法
應用激光粒度儀測定粒徑，樣品用量小、測定方便、快速、重現性較高，在工業界的應用越來越受到重視。激光粒度儀測量方法的理論依據是Fraunhofer 衍射理論和米氏光散射理論，這兩個理論在測量不同粒徑大小的粒子時，有不同的適用性。
圖1. 激光粒度儀設備圖
如圖1所示，粉體分散在空氣流或液體介質中，激光束照射在分散的粉體上，發生衍射和散射，從而產生光強的空間分布變化， 光信號被光電探測器器接收并轉化為電信號。激光粒度儀接收到的散射光是許多顆粒的散射光的集合。很顯然，如果我們知道粒徑分布，可以很容易得出其散射光的結果，但是從散射光集合出發得出粒徑分布，則有多種可能。計算機采用“數學反演”的方式擬合出與實測光強最為接近的粒徑分布情況，而這種擬合總是可能與實測的散射光信號存在差異，因此解讀數據質量則是這種測定方式的重要工作，同時需要優化調整儀器參數，使得測量者更接近于真實值。目前最為常見的激光粒度儀是Malvern Mastersizer，其測得的粒徑一般為體積分布。其測量方式有干法和濕法兩種模式，即粉體分散在空氣流或液體中，其測定下限通常為200nm和20nm。
在激光粒度儀的報告中，常常采用以下值對粒徑結果進行描述：
激光粒度儀也存在一定的缺點。首先從樣品量來講，所需的樣品量一般少于1g，這是其測試的優勢，但在在實踐中，API的量可能達到公斤級別，如何取樣，才能使如此小的量代表整個批量的真實分布情況，這是一個值得思考的問題。在實踐中，可以借鑒混合過程中旋轉取樣和特殊的取樣器，可能可以減小取樣帶來的誤差。但是隨著API的粒徑減小，流動性進一步減小，大批量粉體本身的均勻度就很差，取樣帶來的差異可能難以避免。其次，激光散射法測量粒徑，一般需要設置粉體的折射率、吸收率的參數，這些參數的設置極大地影響粒徑測定結果的可靠性。但是獲取粉體樣品的折射率等參數往往并不容易，若所測得粉體是混合物，那么情況會更為復雜。在實踐中，測量API粒徑時，并沒有提供準確的參數。更通常的做法是根據測試者的經驗，設定通用參數。判斷在這些參數下的數據結果是否接近真實情況，則是較大的挑戰。因此，一個擁有豐富測試經驗和較強的數據解讀能力的分析人員似乎會有很大的幫助。此外，從其測試方法的角度講，測試結果的粒徑分布是從散射的綜合結果“數學反演”得到的，其結果明確指向球形顆粒的粒徑，而大多數情況下，API的并非如此。最后，需要關注激光粒度儀測量本身的平行性問題。通常認為采用激光粒度儀的測量具有很好的重復性，但這種重復性體現在具體測量數值上，可能產生多大的偏差呢？由于儀器的性能不同，所測粉體的性質不同，兩次平行測量中可能產生的誤差可能不同。確定可接受的平行測定誤差，是方法學驗證中內容，即通過對同一均勻粉體多次測量，根據結果來確定偏差限度。但實際測量過程中，特別是在研究的前期，很少能夠完成方法學驗證。中國藥典在介紹光散射法的儀器一般要求時，詳細述采用“標準粒子”評價儀器的結果的接受指標。其中指出，Dv（50）平行測定的RSD不得超過3%，Dv（90）和Dv（10）的平行測定RSD不得超過5%；而對于粒徑小于10μm的粒子，Dv（50）平行測定的RSD不得超過6%，Dv（90）和Dv（10）的平行測定RSD不得超過10%。筆者認為這可以作為測量平行性的最嚴標準，對于實際測量樣品還可適當放寬。
（3）圖像分析
一般通過光學顯微鏡對顆粒進行直接觀察結果更為直觀，可以應用普通的顯微鏡測量0.2~100μm的粒徑。更小的粒徑也可以通過更為精密的儀器如掃描電鏡等方式進行觀察。這些測量一般是對平面進行的觀察，即觀察顆粒在平面的投影。應用原子力顯微鏡等手段也可以用來觀察縱向的尺寸。這種直觀的測量方式可能得到更為精準的與尺寸相關的信息，例如顆粒的形態，形態在某些時候對顆粒的性質也會產生重大影響。
此外，顆粒往往不是球形，并且多不規則，因此難以采用統一的方法測定粒徑。一個較好的做法是，通過計算投影面積，轉換為面積等效圓的直徑。對粒徑進行定量，往往需要借助于圖形，即對圖像中的顆粒的投影進行測量，并根據比例尺進行轉化，很多圖像分析軟件都可以實現這些功能。
為了更好地評估顆粒的粒徑分布，必須計算較大量的粒子尺寸（通常為300~500個），這使得該方法極為繁瑣。但借助于圖形統計分析軟件，如Image Pro Plus（IPP）等，可以快速的對圖像中顆粒的尺寸進行自動識別、測量和統計。能夠用于軟件分析的圖像對質量要求較高，一般要求顆粒顏色深度與背景有明顯的區別，顆粒不能粘連重疊，不能有其他物質干擾（如氣泡）等。
（4）沉降法
采用沉降法測定粒子的粒徑與懸浮介質中粒子的沉降速率有關，應用的是Stokes定律，即對于特定的懸浮介質，粒子在介質中的沉降速率僅僅與基于沉降速率的粒子的平均粒徑有關（流體力學體積）。該定律適用于各種大型不規則形狀的粒子，但所測得粒徑及分布只能看做是相當于球形的當量半徑及分布。
需要注意的是，分散在介質中的粒子不能聚集，聚集體相當于粒徑增大，沉降速率加快，因此需要選擇合適測量介質和合適的去絮凝劑，以保證粒子在介質中分離和分散，如以水為介質時，常加入0.2%的六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉或亞甲基雙萘磺酸鈉等。
此外，粒子在測量過程中，周圍的分散介質必須處于層流狀態，因此沉降速率不能很快，避免產生湍流，一般認為當雷諾數（Re）大于0.2時會出現湍流。根據雷諾數和Stokes定律可以得出，在給定密度和黏度條件下，應用Stokes定律能夠測得的最大粒徑（見下列公式）。
（其中ρs為粒子的密度，ρ0為介質的密度，g為重力加速度，η為分散介質的粘度，Re為雷諾數）
由上述公式可以看出，為了避免出現湍流，應當注意分散介質的粘度和密度。一般而言，對于密度較小的細粒子，分散介質可以選擇水或甲醇等黏度較小的液體，對于密度大的粗粒子，可以選用正丁醇或豆油等黏度較大的液體。
Stokes等效粒徑是對粒子的流體力學性質的直接表征，因而對懸浮劑和乳劑有重要意義。
3、總結
圖2.不同粒徑測量方式的粒徑測量范圍
不同的粒徑測定方式，能夠表征的粒徑范圍不同，從圖2中可以看出，激光粒度儀測得的粒徑范圍最為廣闊。此外，不同的粒徑測量方式原理不同，因此測得粒徑及粒徑分布數值所代表的物理意義也各不相同，將不同方法測得粒徑結果進行比較，可能沒有物理意義，甚至在很多情況下，同一種測量方式下，將不同的物料的粒徑測定結果做簡單比較也沒有實際應用意義。明確粒徑測定的原理，對判斷粒徑測定結果質量的分析以及對粒徑數據的解讀有重要幫助。此外，關于粒徑的表征參數很多，粉體或者最終制劑的成品的某些性質可能僅對某些粒徑指標相關，如制劑的溶出可能與Dv（90）可能更為相關，懸浮液的穩定性可能用Stokes等效粒徑進行評價可能更有相關性。從基本原理出發，“自下而上”地探求性質與結果的關聯，使探索更有方向性，可能對把握關鍵因素更有幫助。
（本文為筆者的讀書筆記，難免有疏漏錯誤之處，請讀者諒解并不吝指正）
參考文獻：
Patrick J. Sinko （劉艷主譯）, 物理藥劑學與藥學，人民衛生出版社；
Mark Gibson et al,Pharmaceutical Preformulation and Formulation;
中國藥典2015版第二部凡例
中國藥典2015版，0982，粒度和粒度分布的測定法；
美國藥典35，0176-0179[429]，Light Diffraction Measurement of Particle Size；
美國藥典35，0336-0339[786]，Particle Size Distribution Estimation by Analytical Sieving；
粉體的粒徑的表述方式及其含義，http://www.360powder.com/technology_details/index/108.html;
激光粒度儀測量數據與篩分測量數據差異問題淺析，https://wenku.baidu.com/view/2b954c9703d8ce2f006623b4.html;
馬爾文粒度儀MS2000原理中文版，https://wenku.baidu.com/view/0867a3f36bec0975f465e28e.html；
學術干貨丨教你用Image Pro Plus統計分析粒徑，http://www.cailiaoniu.com/56881.html；
沉降法測定粒度分布，https://max.book118.com/html/2017/0622/117227278.shtm。
來源：藥事縱橫
