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前言

雙抗（BsAb, bispecific antibodies）是雙特異性抗體或雙功能抗體的簡稱，是一種可以同時特異性結合兩種抗原或同一抗原上的兩個不同表位的人工抗體。在傳統單抗的基礎上，很多雙抗進行了結構改造和修飾，保留了Fc片段，因而具有Fc介導的功能，如較長的血清半衰期，能發揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）、補體依賴的細胞毒作用（CDC）和抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用（ADCP）。部分雙抗基于一些抗體片段進行重組但不含Fc片段，具有較短的半衰期，相對分子量較小，但在腫瘤組織的滲透性較高，具有較低免疫原性等特點[1]，如blinatumomab在動物體內的半衰期為1-3 h，在人體的半衰期為2 h左右。本文將簡介雙抗藥物的作用機制，并通過已上市雙抗藥物的申報資料[2]，總結雙抗類藥物的藥代動力學特征及及研究方法。

雙抗藥物的作用機制

截至目前，全球已獲批13款雙特異性抗體藥物，如表1所示。目前已獲批的13款雙抗藥物中，10款雙抗均用于腫瘤的治療，其余3款中emicizumab用于A型血友病、faricimab用于眼科疾病、bimekizumab用于銀屑病的治療。從作用機制來看，雙抗的生物學功能主要包括如下類型[3]：

a、橋連細胞：如blinatumomab，橋連T細胞和腫瘤。

b、橋連受體：如amivantamab，同時靶向腫瘤表面的EGFR和c-Met受體，可以同時特異性阻斷多條信號通路，以抑制蛋白或新生血管的生成。

c、橋連因子: 如emicizumab，通過同時橋聯結合凝血因子IXa和凝血因子X，從而仿真FVⅢ的生理功能，促進凝血酶的產生。

表1. 已上市的雙特異性抗體藥物

*2017年退市。

#不含有Fc結構域

NSCLC: non-small cell lung cancer，非小細胞肺癌；wAMD: Wet age-related macular degeneration，濕性年齡相關性黃斑變性；DME: Diabetic macular edema. 糖尿病性黃斑水腫。DLBCL：diffuse large B-cell lymphoma，彌漫性大B細胞淋巴瘤。MM：multiple myeloma，多發性骨髓瘤。

友芝友生物制藥在Antibody Therapeutics發表綜述文章[4]，將雙抗的作用機制分為如下6種：

通過雙抗招募T細胞對靶標細胞進行殺傷（圖1B）。

雙免疫檢查點阻斷。將雙免疫檢查點阻斷劑整合到一種抗體中，同時抑制兩個免疫檢查點，增強免疫細胞對腫瘤細胞的擊殺（圖1C）。

通過雙抗同時抑制兩個信號通路（圖1D）。

通過雙抗進行共同定位阻斷，抑制腫瘤細胞兩個信號通路，提高抗腫瘤活性，獲得比單一療法更好的效果。圖1E）。

雙抗作用于同一個抗原的不同表位，增強抗體對腫瘤抗原的相互作用（圖1F）。

腫瘤靶向調節免疫性雙特異抗體—雙抗結合腫瘤表面抗原后，通過另一個可以調節免疫細胞的靶點進行免疫細胞的調節，增強治療效果（圖1G）。

圖1. 雙抗的作用機制[4]

已上市雙抗藥物的藥代動力學特征及藥代動力學相關信息

1、臨床前動物選擇

抗體類藥物的臨床前動物種屬選擇一般根據藥效實驗決定，通過體外實驗測試藥物和靶點的親和力或體外活性測試以決定相關動物種屬。不同于單靶點的單抗藥物，雙抗需要選擇與兩個靶點高親和力的相關動物種屬，這為雙抗藥物的臨床前動物選擇可能帶來挑戰。如blinatumomab僅與大猩猩和人種屬的CD19和CD3顯示出親和性，與食蟹猴、恒河猴、非洲綠猴、松鼠猴、狒狒、比格犬、大鼠、小鼠的CD19和CD3均無結合或弱結合。由于與嚙齒動物沒有親和力，blinatumomab使用了鼠源的替代藥物開展嚙齒動物的相關研究。Mosunetuzumab的相關大動物種屬為食蟹猴，但沒有相關的嚙齒動物，采用的是huCD20/CD3轉基因小鼠開展相關研究。種屬選擇符合ICH S6指導原則的要求。

2、劑量線性

與單抗藥物類似，雙抗藥物體現出與化學小分子藥物不同的劑量線性特征。如amivantamab的劑量≥20 mg/kg/week時，在食蟹猴體內系統暴露量呈現線性，當劑量< 20 mg/kg/week呈現非線性PK，可能與靶點介導的藥物處置TMDD（target-mediated drug disposition）有關。Glofitamab體內的清除率與劑量和循環系統的B細胞數量相關，表明TMDD也參與了藥物消除。

3、性別差異

在已上市的雙抗藥物中，開展了性別差異比較的實驗結果均顯示沒有性別差異。

4、給藥途徑與吸收

大部分通過IV、SC或IM等注射途徑給藥，用于眼科疾病的faricimab通過玻璃體注射（IVT）給藥。通過非IV給藥途徑的生物利用度一般或良好，如elranatamab在SC給藥后生物利用度為56%；emicizumab在SC給藥后生物利用度為80%-93%，在腹部、上臂和大腿皮下不同部位進行SC給藥后沒有明顯差異。

5、分布

已上市雙抗均沒有開展分布研究，和單抗類似，由于這些雙抗分子量較大，一般認為分布在循環系統和細胞外液中。

6、消除

和單抗一樣，已上市雙抗藥物均沒有開展代謝和排泄的相關研究，一般認為其經體內蛋白水解而消除。

7、生物分析[5]

雙抗類藥物生物分析主要通過配體結合分析（Ligand binding assay）平臺進行分析，考慮到雙抗本身的結構，通常可采用總抗體（Total），游離X（Free X），游離Y（Free Y）和完整抗體（Intact）這四類檢測形式（Assay format）。這里用配體作為捕獲或檢測關鍵試劑示例，也可以適用抗獨特性抗體（Anti-idiotype antibody）作為關鍵試劑。需要根據雙抗藥物的靶點信息、抗體結構、研究階段等選取合適的檢測形式以及關鍵試劑。FDA指導原則[5b]推薦使用多個不同檢測方法共同表征雙抗藥物的結構完整性和代謝情況，但是也需要注意方法之間的橋接和干擾，確保定量數據之間可以互相參考。

值得注意的是，對于特定類型的雙抗藥物，例如前藥雙抗（BsAb prodrug），這類藥物通常結構復雜，具有遮蔽肽（Masking peptide）等結構，在體內的代謝形式包括了完整形態以及X活性形態，Y活性形態以及X和Y活性形態等。由于結構復雜，因此需要檢測的分子類型較多，很難通過經典的配體結合來進行分析，更適合使用基于免疫富集的LC/MS平臺進行分析，通過檢測特征性肽段（surrogate peptide）來評估雙抗藥物的完整性。

圖2. 雙抗生物分析檢測形式示意圖

8、免疫原性及生物分析

由于雙特異性抗體的分子結構非自然存在，增加了其產生免疫原性的可能性，同時降低了藥物的安全性和療效，還可能導致通過形成抗藥抗體，誘發嚴重的藥物相關毒性反應或過敏反應。但根據目前上市雙抗的臨床資料來看，形成抗藥抗體的幾率較低。如emicizumab在臨床研究中發現了4名患者產生了ADA，約占為2.8%。在食蟹猴的MTD研究中所有的食蟹猴在給藥168-336 h后，雖然glofitamab均出現了很強的ADA效應（12/12），但在臨床研究中產生ADA的幾率僅為1.1% (5/448)。Blinatumomab在臨床研究中<1%的患者產生ADA。Mosunetuzumab的臨床研究中評估了418名患者的免疫原性，均沒有檢測到ADA，可能與藥物的作用機制有關，因為mosunetuzumab活化T細胞殺傷B細胞導致B細胞耗竭。

通常需要根據研究階段選擇雙抗類藥物的免疫原性研究內容[6]，例如在早期臨床前研究階段，進行總抗藥抗體（ADA）的分析可輔助PK/TK數據的解讀；在新藥臨床試驗申請（IND）階段需要增加免疫毒性以及免疫細胞分型的分析；在臨床研究階段需要根據實際情況進一步完善免疫毒性或者中和抗體（Nab）的分析。

對于最常見的總抗藥抗體的分析，通常使用經典的橋接法的ADA檢測形式（圖3），使用篩選、確證和滴度三步法進行ADA的半定量分析。

圖3. ADA橋接法檢測形式示意圖

9、細胞因子釋放綜合征(CRS)

上市的雙抗藥物以CD3靶點居多，CD3較高的親和力可導致雙抗在尚未結合腫瘤細胞時就活化T細胞，誘發IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-2、IL-2R和IL-8等細胞因子快速劇烈地釋放，引發細胞因子風暴。另外，雙抗的Fc結構域與其他效應細胞表面的FcR結合，也可能會誘發細胞因子風暴。Catumaxomab結合至免疫細胞和腫瘤細胞后將啟動前炎性因子和細胞毒性細胞因子的釋放，約90%的患者出現發熱、惡心、嘔吐和寒戰等細胞因子釋放綜合征癥狀。在臨床研究中，為了控制疼痛和發熱，在catumaxomab給藥之前先用對乙酰氨基酚處理。盡管進行了預防性用藥，但仍有較大比例的患者出現了3級以上的不良反應。由于副作用較大，catumaxomab于2017年官宣退市。

Glofitamab在給藥前用obinutuzumab預處理以降低外周B細胞數量，從而降低CRS風險，由于可能的嚴重副作用，glofitamab批準上市時加了黑框警告。elranatamab也可引起CRS，因此臨床上推薦逐步增加劑量以降低CRS風險，elranatamab批準上市時加了黑框警告。

對于CD3靶點的雙抗在開展非臨床PK實驗時，建議逐步增加劑量開展PK實驗，低劑量給藥后觀察幾天，待動物沒有明顯的臨床反應再逐步增加劑量。

10、藥物相互作用[7]

2023年6月FDA發布了治療性蛋白的藥物相互作用的指導原則，指出一些促進細胞因子釋放的藥物，如blinatumomab會導致促炎細胞因子（例如IL-6）水平增加而下調細胞色素P450（CYP450）酶的表達，從而降低作為CYP450底物的藥物的代謝并增加其暴露水平。由于多數上市的雙抗有誘導細胞因子釋放的風險，在臨床上合并用藥的情況下，對于CYP450的底物可能需要監測其濃度變化情況，并根據需要對用藥劑量進行調整。

Mosunetuzumab在FDA的上市申請資料里包括了基于IL-6和CYP3A4相互作用的生理學藥代動力學（PBPK）建模研究，表明mosunetuzumab引起的細胞因子釋放對細胞色素P450酶表達或活性風險較低。咪達唑侖的濃度-時間曲線下面積（AUC）和最大濃度（Cmax）比值在合用與不合用mosunetuzumab 的情況下預測值分別為1.37和1.17。因此mosunetuzumab與CYP3A底物的小分子藥物合用時，不建議調整其劑量。

11、首次人體劑量預測

曾經靶向CD28的T細胞激動劑TGN1412的臨床經驗值得汲取[8]。CD3高的親和力也可能會導致雙抗過度活化T細胞，引發細胞因子風暴。不合適的臨床劑量也可能導致嚴重的臨床事故。安全起見，CD3靶向的雙抗在首次臨床劑量設計時推薦使用MABEL的方法[9]。例如glofitamab首次人體劑量采用的就是MABEL的方法。

結語

相比于單抗，雙抗由于能同時靶向兩個靶點，有更好的特異性，降低脫靶毒性等優勢，已成為抗體藥物研發的新方向。同時，三抗、多特異性抗體以及雙抗ADC等新的藥物形式也陸續涌現，這也將為病患提供更多和更優的治療選擇。目前藥明康德DMPK已服務十余家客戶的雙抗項目，團隊具有豐富的PK項目和生物分析經驗，希望能助力雙特異性抗體類新藥的開發和研究。

參考文獻：

[1] Labrijn AF, Janmaat ML, Reichert JM，et al. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. Nat Rev Drug Discov, 2019, 18, 585-608.

[2] 上市雙抗藥物的pharmacology review.

[3] NMPA, 2022年11月《雙特異性抗體類抗腫瘤藥物臨床研發技術指導原則》。

[4] Zhang J, Yi J, Zhou P. Development of bispecific antibodies in China: overview and prospects. Antib Ther. 2020, 3, 126-145.

[5] (a) Lee J W, Kelley M M, King L, et al. Bioanalytical Approaches to Quantify “Total” and “Free” Therapeutic Antibodies and Their Targets: Technical Challenges and PK/PD Applications Over the Course of Drug Development[J]. Aaps Journal, 2011, 13, 99-110. (b) FDA guidance, 2021年5月，Bispecific Antibody Development Programs.

[6] Gorovits B, Wakshull E, Pillutla R, Xu Y, Manning MS, Goyal J. Recommendations for the characterization of immunogenicity response to multiple domain biotherapeutics. J Immunol Methods. 2014, 408, 1-12.

[7]（a）FDA guidance, 2023年6月，Drug-Drug Interaction Assessment for Therapeutic Proteins Guidance for Industry. (b) Lee J, L Zhang, AY Men, LA Kenna, and SM Huang, CYP-Mediated Drug-Therapeutic Protein Interactions: Clinical Findings, Proposed Mechanisms and Regulatory Implications, Clin Pharmacokinet, 2010, 49, 295-310. [c ] Le Vee, M., Lecureur, V., Stieger, B. & Fardel, O. Regulation of drug transporter expression in human hepatocytes exposed to the proinflammatory cytokines tumor necrosis factoralpha or interleukin-6. Drug Metab. Dispos. 2009, 37, 685–693.

[8] Goodyear M. Learning from the TGN1412 trial. BMJ. 2006, 332, 677-678.

[9] Trivedi A, Stienen S, Zhu M, et al. Clinical Pharmacology and Translational Aspects of Bispecific Antibodies[J]. Clinical and Translational Science, 2017, 10, 147-162.