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嘉峪檢測網 2025-04-01 08:31
1. 實驗原理
Transwell實驗是一種用于研究細胞遷移和侵襲能力的體外實驗方法。其原理是利用帶有微孔的聚碳酸酯膜將實驗裝置分隔成上下兩部分。上腔加入待測試細胞，下腔加入含有趨化因子的培養基，形成化學濃度梯度。
細胞在趨化因子的刺激下，通過變形穿過微孔到達下腔，從而模擬體內細胞的跨膜運動。實驗者可以通過染色或計數遷移至下腔的細胞，評估其遷移或侵襲能力，該方法廣泛應用于腫瘤轉移、免疫細胞趨化和藥物篩選等研究領域。
圖1 transwell細胞遷移測定圖[1]
2. 實驗材料
耗材：Transwell小室、24孔板、培養皿、6孔板、棉簽
試劑：無血清培養基、胎牛血清、胰酶、4%多聚甲醛固定液、結晶紫染液、PBS
設備：離心機、倒置顯微鏡、細胞計數儀、培養箱
3. 實驗步驟
3.1 細胞培養與接種
將對數期生長的細胞鋪于6孔板，如需要敲低某基因，則鋪板密度控制在30%-40%左右；如需讓某個基因過表達，則鋪板密度控制在60%-70%左右。
3.2 細胞處理
細胞貼壁培養24 h后，根據實驗設計進行相應處理，如可進行siRNA轉染以干擾特定基因表達，或者通過質粒轉染來過表達目的基因。
3.3 細胞收集與制備
處理結束后，消化細胞并進行離心收集，并用無血清培養基重懸。
細胞計數，一般每個Transwell小室接種5×104個細胞，但具體接種量需結合實驗優化，如目的細胞長得很慢則需要適當多接種細胞，第一次試驗時可在同一次實驗中平行設計不同濃度來對比效果。
3.4 Transwell小室細胞接種與培養
將計數好的細胞重懸，準備24孔Transwell板，取100 µL懸滴加入Transwell上室，加入700 µL含20%FBS的完全培養基于下室，以建立穩定的趨化誘導環境，誘導細胞發生遷移行為。
然后輕輕將Transwell裝置置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育24或48h，具體培養時間可根據實驗需求進行調整和優化（若實驗需要加入藥物刺激后看遷移結果，可給小室中加入適量藥物）。
3.5 細胞固定與染色
培養結束后，取出Transwell小室，并用PBS清洗，隨后，將小室轉移到干凈的24孔板中，并用4%的多聚甲醛和0.1%的結晶紫染液固定染色15 min。
染色后，再次用PBS清洗2遍，以去除多余染料，之后用棉簽輕輕擦除Transwell上室未遷移的細胞，確保僅保留的是已穿透膜的細胞（可通過肉眼或顯微鏡觀察上，如果沒有明顯的細胞團塊或細胞聚集的跡象，且上室表面看起來相對干凈、均勻，沒有明顯的深色，可判斷未遷移細胞已被大部分清除）。
3.6 顯微鏡觀察與圖像采集
倒置顯微鏡拍照，將小室置于載玻片上，分別使用10X和20X物鏡，從左至右依次拍攝多個視野，保存圖片以備后續image J分析。
3.7 Transwell小室清洗
實驗結束后，為了便于小室的重復利用，可對小室清洗和消毒：先用胰酶消化5 min，去除殘留在小室的細胞；用75%酒精進行浸泡消毒，去除殘留物；最后，放置于紫外線燈下照射消毒，以確保小室的無菌狀態，以便下次使用。
圖2 transwell檢測細胞遷移的結果圖，右邊為定量分析圖[2]
4. 注意事項
合理控制細胞數量是取得實驗成功的關鍵，正式實驗前可先做預實驗，摸索適當的密度，不然可能會影響結果的準確性。
在取出Transwell孔板進行觀察前，先用PBS沖洗，以去除未貼附或懸浮的細胞，洗完后應立即固定染色，防止細胞過于干燥，染色時間也不能太長或太短。
小室需確認放平于孔板中且細胞懸液要混勻，建議滴加，整個實驗過程中小室勿傾斜晃動，以防止細胞鋪不均勻。
滴加細胞懸液的過程中要注意防止氣泡產生。
Transwell孔板的孔徑選擇：8 μm規格適配實體瘤細胞的跨膜運動分析，而3 μm微孔系統則專用于淋巴細胞亞群的定向趨化行為檢測。
5. 參考資料
[1] Justus C R, Marie M A, Sanderlin E J, Yang L V. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays [J]. Methods in molecular biology (Clifton, NJ), 2023, 2644: 349-359.
[2] Hu R, Cao Y, Wang Y, Zhao T, Yang K, Fan M, Guan M, Hou Y, Ying J, Ma X, Deng N, Sun X, Zhang Y, Zhang X. TMEM120B strengthens breast cancer cell stemness and accelerates chemotherapy resistance via β1-integrin/FAK-TAZ-mTOR signaling axis by binding to MYH9 [J]. Breast cancer research : BCR, 2024, 26(1): 48.
來源：實驗老司機
