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本文主要介紹了安徽達(dá)健醫(yī)學(xué)科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

一、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的主要組成成分

試劑盒 I：亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（離心柱型） 

試劑盒 II：PCR 擴(kuò)增試劑盒

注：不同批號(hào)的試劑盒中各組分不可以互換使用。具體內(nèi) 

容詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

二、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的預(yù)期用途

本試劑盒用于體外定性檢測(cè)尿脫落細(xì)胞中膀胱癌相關(guān)Twist1基因甲基化狀態(tài)。本產(chǎn)品用于初診膀胱癌的輔助診斷。 

膀胱癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是引起泌尿系統(tǒng)腫瘤患者死亡的第二大腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌可以增加手術(shù)保留膀胱的機(jī)會(huì)并提高患者總體生存率。研究發(fā)現(xiàn)可以在膀胱癌組織和患者尿液中檢測(cè)到膀胱癌相關(guān)Twist1基因存在過(guò)度甲基化，檢測(cè) Twist1 基因甲基化狀態(tài)可以用于初診膀胱癌的輔助診斷。本試劑盒采用甲基化特異性實(shí)時(shí)熒光 PCR 法檢測(cè)尿脫落細(xì)胞中膀胱癌相關(guān) Twist1 基因的甲基化狀態(tài)，是一種初診膀胱癌輔助診斷方法。本試劑盒適用于血尿、尿頻、尿急和尿痛等臨床上疑似膀胱癌、臨床診斷建議進(jìn)行膀胱鏡檢查患者的輔助診斷。本產(chǎn)品僅作為現(xiàn)有診斷方法的補(bǔ)充和輔助，供臨床醫(yī)師參考。

三、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的包裝規(guī)格 

20 人份/盒、50 人份/盒 

四、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的檢驗(yàn)原理 

本產(chǎn)品包括兩個(gè)步驟： 

步驟I，用試劑盒I將提取的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。

步驟II，將亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA（Bis-DNA）做PCR擴(kuò)增，試劑中含有膀胱癌相關(guān)Twist1基因甲基化特異性引物探針和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）引物探針。甲基化特異性引物探針能與膀胱癌相關(guān)甲基化Twist1基因序列特異性結(jié)合，可以在PCR反應(yīng)中特異地檢測(cè)出甲基化序列。同時(shí)，內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）可監(jiān)控每個(gè)樣本的提取及PCR反應(yīng)管的擴(kuò)增情況，從而避免假陰性或部分抑制結(jié)果的發(fā)生。另外，試劑盒還提供了陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，需在每一次檢測(cè)中同時(shí)加入。 

五、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的主要原材料選擇

本產(chǎn)品的主要原材料包括 dNTP、Taq 酶、亞硫酸氫鹽、引物和探針。這些原材料均是通過(guò)外購(gòu)的方式獲得。 

其中引物、探針的序列由達(dá)健醫(yī)學(xué)自行設(shè)計(jì)，由合成公司經(jīng)過(guò)合成、修飾、純化方式獲得；Taq 酶由原材料供應(yīng)商克隆表達(dá)后獲得；dNTP、亞硫酸氫鹽由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得。 

達(dá)健醫(yī)學(xué)對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過(guò)功能性試驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。 

六、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況

本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢出限參考品。

企業(yè)參考品包括 Twist1 基因相應(yīng)位點(diǎn)甲基化陽(yáng)性的樣本，這些樣本Twist1基因的甲基化狀態(tài)均經(jīng)過(guò)數(shù)字PCR方法驗(yàn)證。

陽(yáng)性參考品包括 3 種，分別命名為陽(yáng)性參考品 P1-P3，為一定 DNA 濃度下 Twist1 基因不同甲基化比例的樣本。陰性參考品包括 4 種，分別命名為陰性參考品 N1-N4，其中 N1 為一定濃度下含有低于檢出限的甲基化 Twist1 基因樣本，N2-N4 為一定濃度下分別含有其它不同腫瘤相關(guān)的基因甲基化的樣本。 

精密度參考品包括 3 種，分別命名為 J1-J3，其中 J1 為非膀胱癌患者樣本，J2 和 J3 為一定 DNA 濃度下 Twist1 基因不同甲基化比例的樣本。 

檢出限參考品包括 3 種，分別命名為 L1-L3，為一定低甲基化比例下不同濃度的樣本。 

本試劑盒同時(shí)設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，用于檢測(cè)過(guò)程中的試劑和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個(gè)樣本均檢測(cè)內(nèi)參基因GAPDH，用于結(jié)果的判讀及評(píng)估樣本的質(zhì)量。 

七、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究 

達(dá)健醫(yī)學(xué)對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究包括引物探針濃度的確定、DNA 聚合酶用量的確定、PCR 緩沖液用量的確定、鎂離子濃度的確定、dNTP 濃度的確定、PCR 反應(yīng)體積的確定、PCR 模板體積的確定、轉(zhuǎn)化液用量的確定、緩沖液濃度的確定、結(jié)合液濃度的確定、脫磺液濃度的確定等；對(duì) PCR 反應(yīng)條件的研究包括退火溫度及時(shí)間、預(yù)變性溫度及時(shí)間、變性時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳反應(yīng)體系。

達(dá)健醫(yī)學(xué)根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。

八、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的分析性能評(píng)估研究

本產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、分析特異性、企業(yè)參考品的符合性、不同規(guī)格性能研究、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化效率等研究。

準(zhǔn)確度研究中，達(dá)健醫(yī)學(xué)選擇了若干臨床尿液樣本對(duì)試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示試劑盒檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性符合率為100%、陰性符合率為96.67%。

精密度研究中，達(dá)健醫(yī)學(xué)使用精密度參考品，分別用三批次試劑盒由兩位操作者在 20 天進(jìn)行連續(xù)的檢測(cè)。結(jié)果顯示試劑盒對(duì)精密度參考品的批內(nèi)、日間、批間、儀器、人員和地點(diǎn)間的檢測(cè)變異系數(shù)均小于等于 5%。

檢出限研究中，以陰性尿液樣本為基質(zhì)，采用不同濃度、不同甲基化比例的模擬樣本，每個(gè)濃度梯度的樣本檢測(cè) 20 次進(jìn)行檢出限的確認(rèn)。使用連續(xù)生產(chǎn)的三個(gè)批次的試劑盒，用多例真實(shí)臨床樣本在檢出限濃度水平上進(jìn)行檢出限的驗(yàn)證。明確了試劑盒的檢出限為 5ng/uL 的野生型 DNA 背景下，5% 的 Twist1 甲基化 DNA。

分析特異性研究包含交叉反應(yīng)和干擾研究，交叉反應(yīng)研究包括其它基因甲基化的樣本、轉(zhuǎn)化前尿液樣本、常見(jiàn)尿道微生物樣本，均無(wú)交叉反應(yīng)；用三批試劑盒檢測(cè)其它惡行腫瘤患者尿液樣本，包括肝癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌，結(jié)果顯示均無(wú)交叉反應(yīng)。在上尿路腫瘤特異性研究中，檢測(cè)結(jié)果顯示試劑盒對(duì)上尿路腫瘤（輸尿管癌、腎盂癌）有一定的陽(yáng)性檢出率，試劑盒檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。

干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，尿液中分別含有以下干擾物：尿酸（1.4mmol/L）、葡萄糖（55mmol/L）、抗壞血酸（170μmol/L）、白蛋白（60g/L）、酮體（12mmol/L）、尿膽原（10.65μmol/L）、亞硝酸鹽（120mg/L）、pH 為 8.0、氨（107μmol/L）、甘油三酯（37mmol/L）、血紅素（2g/L）、維生素 C（170μmol/L），常用藥物如鹽酸左氧氟沙星（1.08g/L）、四環(huán)素（780mg/L）、青霉素（27g/L）、頭孢克肟（426.6mg/L）、布洛芬膠囊（478.8mg/L）、感冒靈膠囊（9g/L）對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。膀胱癌常用灌注治療藥物卡介苗（360mg/L）、絲裂霉素（120mg/L），表柔比星（150mg/L）會(huì)影響檢測(cè)的敏感性，因此接受化療藥物治療后 1 個(gè)月內(nèi)勿留樣檢測(cè)。

企業(yè)參考品的符合性研究中，達(dá)健醫(yī)學(xué)分別使用三批試劑盒對(duì)陽(yáng)性參考品和陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率、陰性符合率均為 100%。

達(dá)健醫(yī)學(xué)采用臨床尿液樣本進(jìn)行了核酸提取試劑盒性能研究，并根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究結(jié)果，確定推薦的核酸提取試劑符合檢測(cè)要求。

九、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間研究

本產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值的研究采用真實(shí)尿液樣本。陽(yáng)性判斷值研究入組（包括建立和驗(yàn)證）有效樣本數(shù)共計(jì) 164 例，樣本來(lái)源包括膀胱癌患者、腎細(xì)胞癌患者、前列腺癌患者、輸尿管癌患者、腎盂癌患者、輸尿管炎、尿路上皮增生、膀胱無(wú)病變?nèi)巳旱取?nbsp;

采用百分位數(shù)法確定內(nèi)標(biāo)基因的 Ct 值的范圍，內(nèi)標(biāo)基因 Ct 值≤25 時(shí)判定樣本合格。采用 ROC 曲線(xiàn)法和約登指數(shù)確定試劑盒陽(yáng)性判斷值為10。當(dāng)ΔCt值≤10時(shí)判斷為陽(yáng)性，ΔCt 值＞10 時(shí)判斷為陰性。 

十、人Twist1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究

達(dá)健醫(yī)學(xué)對(duì)該產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究包括貨架效期穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性（包括開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性）及樣本穩(wěn)定性（包括尿液、尿液提取 DNA 及尿液提取轉(zhuǎn)化后 DNA的穩(wěn)定性）。 

貨架有效期穩(wěn)定性：將三批試劑盒置于規(guī)定儲(chǔ)存條件下放置 0、2、4、6、8 個(gè)月，每到一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)使用企業(yè)參考品對(duì)試劑盒的性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示試劑盒在生產(chǎn)后保存至 8 個(gè)月各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合產(chǎn)品技術(shù)要求，產(chǎn)品有效期可達(dá) 6 個(gè)月。 

此外，達(dá)健醫(yī)學(xué)對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均能滿(mǎn)足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的聲稱(chēng)。