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嘉峪檢測網 2024-07-06 20:06
摘 要 / Abstract
致癌性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要內容之一。當前國內外普遍采用并認可基于ICHS1B 指南建立的藥物非臨床致癌性試驗替代方案。遺傳修飾致癌性小鼠模型是替代方案中“卡脖子”的關鍵技術問題。從1997 年ICH S1B 指南發布至今，我國制藥行業主要依賴進口獲得小鼠模型，其價格高昂、進口周期長、條件嚴苛，且由于模型資源唯一，制藥行業承受著成本高昂和供應鏈不穩的雙重壓力。本文概述了國內外致癌性試驗相關指導原則，介紹了國內外主要的致癌性小鼠模型，包括Tg.rasH2、KI.C57-ras、p53+/- 小鼠等的構建、驗證與應用歷程，并展望了建立我國自主知識產權的致癌性小鼠模型以及標準化生產供應的途徑。
The assessment of carcinogenicity is a pivotal element in the preclinical safety evaluation of pharmaceuticals. The alternative approach to non-clinical carcinogenicity assessment, as outlined in the ICH S1B guidelines, is widely endorsed both domestically and internationally. However, the development of genetically modified mouse models for carcinogenicity poses significant technical challenges within this alternative approach. Since the issued of the ICH S1B guidelines in 1997, China's pharmaceutical industry has heavily relied on costly and lengthy imports from overseas, which are subject to stringent conditions. Moreover, due to monopolied resources being controlled by Western countries, the pharmaceutical industry faces mounting pressure from high costs and unstable supply chains. This article outlines relevant guidelines for carcinogenicity evaluation at home and abroad, introduces the global development, validation, and application history of major carcinogenicity mouse models such as Tg.rasH2, KI.C57-ras V2.0, p53+/- mice; it also looks ahead to establishing independent intellectual property rights for domestically produced carcinogenicity mouse models while standardizing their production and supply.
關 鍵 詞 / Key words
藥物致癌性試驗；致癌性小鼠模型；指導原則；遺傳修飾動物模型
pharmaceutical carcinogenicity test; carcinogenicity mouse model; guidelines; genetically modified animal models
致癌性試驗是藥物非臨床安全性評價中的重要內容， 也是藥物毒理學研究中的重要評價指標， 旨在考察藥物在動物體內的潛在致癌作用， 從而評價和預測其可能對人體造成的危害。國際人用藥品注冊技術協調會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）發布的《S1A ：藥物致癌性試驗必要性指導原則》（Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals S1A）指出， 臨床預期用藥6 個月以上（含6 個月）或治療慢性復發性疾病而需間歇使用的藥物以致總暴露量與前者相似的藥物均需進行致癌性試驗[1]。傳統的致癌性試驗方法框架是通過為期2 年的大鼠和小鼠的致癌性試驗完成的。20 世紀90 年代開始， 歐盟、美國等國家和地區開展了遺傳修飾動物模型的短期致癌性試驗方法的研究。1997 年， ICH 發布了《S1B ：藥物致癌性試驗》（Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals S1B）[2]，建議藥物臨床前致癌性試驗采用遺傳修飾動物模型開展試驗，該指導原則中新藥潛在致癌性評價改為一項大鼠長期致癌性試驗加上一項短期或中期體內試驗，使用的模型包括嚙齒類引發- 促進模型、遺傳修飾小鼠模型和新生嚙齒類動物致腫瘤模型，以縮短試驗周期，減少動物用量并降低費用。2010 年，我國發布實施《藥物致癌試驗必要性的技術指導原則》，鼓勵國內制藥企業開展新藥的短期致癌性評價試驗[3]。
ICH S1B 指導原則中的遺傳修飾小鼠模型一般指Tg.rasH2 轉基因小鼠模型、p53+/- 基因敲除小鼠模型、Tg.AC 轉基因小鼠模型及Xpa-/-基因敲除小鼠模型[4-5]，其構建的方法為傳統的轉基因技術（例如Tg.rasH2 轉基因小鼠）或干細胞打靶法（例如p53+/- 基因敲除小鼠），但研究人員逐漸發現傳統轉基因技術存在著不足。隨著基因編輯技術的發展[6]，研究人員利用新型打靶技術構建了多種抑癌基因敲除或原癌基因激活的致癌性小鼠模型。這些新型遺傳修飾小鼠模型與傳統小鼠模型相比，具有動物用量少、試驗周期短、費用低、特異性及敏感性高等多重優勢，為推動新藥研發提供了更實用的模型工具[7]。
本文從新藥臨床前致癌性試驗方法進展、國內外致癌性試驗相關指導原則的發布及現有致癌性小鼠模型的建立等3 個方面概述了遺傳修飾動物模型在致癌性試驗中的應用，以探索建立我國自主知識產權的致癌性小鼠模型的途徑。
1、新藥臨床前致癌性試驗方法進展
近年來，新藥致癌性試驗技術方法不斷更新和完善。致癌性試驗主要包括體外試驗、體內試驗和流行病學調查等方面。體內試驗是藥物毒理學評價的重要環節，尤其是動物模型的優化和新型動物模型的建立，為致癌性試驗方法發展提供了更科學的技術工具[8]。致癌性試驗經歷了2 年期大鼠和小鼠致癌性試驗和2 年期大鼠和6 個月小鼠模型替代致癌性試驗2 個發展階段。2 年期致癌性試驗通常選用兩種嚙齒類動物（大鼠和小鼠）進行評價，被視為致癌性試驗的“ 黃金標準”。在該致癌性試驗的分析中，國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer）和美國國家毒理學計劃（National Toxicology Program） 都得出結論， 嚙齒類動物2 年期的致癌性試驗結果與人類真實致癌反應高度一致[9-10]。雖然也存在局限性[11-12]， 但美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、美國環境保護局（Environmental Protection Agency，EPA） 和全球其他國家和地區的相關監管機構均接受了2 年期致癌性試驗數據，進一步考慮到致癌性試驗持續時間長、成本高的客觀現實，通常建議在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗完成后進行致癌性風險評價。6個月替代致癌性試驗是1997 年ICH S1B 指導原則中正式提出的新評價框架，即選用一種常規嚙齒類動物（大鼠）和一種嚙齒類動物替代模型（多指致癌性遺傳修飾小鼠模型）進行致癌性試驗，同時強調使用證據權重（weight of evidence，WoE） 對藥物的致癌性信息和試驗結果進行總體風險評估[2]。其中選用的小鼠替代模型是在20 世紀80 年代~90年代由多個國家和地區的科學家們構建并聯合驗證的、針對不同致癌基因或抑癌基因編輯產生的轉基因或基因敲除小鼠模型。近年來，短期致癌性試驗方法成為美國、日本、歐盟等國家和地區的藥品監管機構普遍認可并接受的新藥申報方法[13]。
替代性毒理學新技術在一定范圍內興起和發展，包括體外方法、計算機模擬、毒理基因組學等，尤其是器官芯片技術的快速發展促進了非遺傳毒性藥物的致癌性預測和致癌機制研究[14-15]。雖然，多個國家和地區的藥品監管機構已認識到毒理基因組學在藥物研發中的重要性，但如何準確評價器官芯片的性能、推動其從藥物研發到注冊及監管的應用仍面臨諸多問題[16]。
可以預計，未來研究人員將會繼續關注和發展新的致癌性試驗替代方法，但基于體內試驗評價新藥潛在致癌性風險還是必要的。
2、國內外致癌性試驗相關指導原則的建立
2.1 國外致癌性試驗相關指導原則
全球多個國家和地區的藥品監管機構和組織，包括ICH、FDA、EMA 等已經制定并實施了致癌性試驗指導原則， 已形成了成熟的致癌性試驗評價體系。1995 年，ICH 陸續推出了S1A、S1B、S1C 系列技術指導原則。隨后，FDA 發布了《嚙齒類動物致癌性試驗設計和結果分析的統計學考慮》（Statistical Aspects of the Design, Analysis, and Interpretation of Chronic Rodent Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals） 及《致癌性試驗設計方案的提交》（Carcinogenicity Study Protocol Submissions）等技術指導原則。FDA 發布的《神經毒性研究紅皮書》（Redbook 2000: IV.C.10.Neurotoxicity Studies）作為實用性很強的指導方針， 以草案形式提供了關于設計和開展致癌性評價的具體方法。不過，《神經毒性研究紅皮書》中提供的研究設計被認為是最基本的設計， 實用性略欠缺。EMA 發布的《人類胰島素類似物致癌潛力的非臨床評估科學指南》（Non-Clinical Assessment of the Carcinogenic Potential of Human Insulin Analogues – Scientific Guideline）、《CHMP SWP 關于使用轉基因動物模型開展致癌性試驗的結論和建議科學指南》（CHMP SWP Conclusions and Recommendations on the Use of Genetically Modified Animal Models for Carcinogenicity Assessment -Scientific Guideline）、《治療HI V感染的藥品致癌性評價指南》（Carcinogenicity Evaluation of Medicinal Products for the Treatment of HIV Infection -Scientific Guideline）指導原則中也提出了藥物潛在致癌性試驗的注解。這些致癌性試驗指導原則內容涵蓋了致癌性試驗設計、開展的必要性、數據統計學分析、考慮要點、劑量選擇等方面。2022 年，ICH 再次發布了《S1B（R1）：藥物致癌性試驗》[Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals S1B (R1)] 附錄，該指導原則再次強調了3R 原則（the rules of 3R），提出了WoE方法評估2 年期大鼠的致癌性試驗的價值，但該指導原則仍推薦開展小鼠致癌性試驗，可見遺傳修飾的致癌性小鼠模型的應用價值。S1B（R1）指導原則附錄的發布，既減少了動物的使用，將資源集中到更加科學的、基于機制的致癌性試驗上，同時持續推進創新藥安全并合乎倫理的研發。
2.2 我國致癌性試驗相關指導原則
我國在藥物致癌性試驗領域起步較晚，近些年先后也發布了一系列的法規和指導原則，已經初步搭建了致癌性試驗管理體系。2005 年版《藥品注冊管理辦法》附件中規定預期臨床連續用藥6個月以上或需經常間歇使用的藥物必須提供致癌性試驗資料，并指出了進行致癌性試驗的多個考慮因素。2007 年，《治療用生物制品非臨床安全性技術審評一般原則》發布，闡述了相關產品致癌性試驗的要求。2009 年， 原國家食品藥品監督管理局藥品審評中心組織毒理專家、企業及研究單位代表召開了制定“藥物致癌試驗必要性技術指導原則”專題討論會，會上基本認同了ICHS1A 中內容的適用性，并結合我國國情進行了調整，《藥物致癌試驗必要性的技術指導原則》于2010 年4 月1 日發布。該指導原則旨在闡明在何種情況下需要進行藥物致癌性試驗，以及進行致癌性試驗的考慮因素和致癌性試驗的時間安排等。該指導原則的發布意味著我國開展新藥致癌性試驗的工作進入新階段。
2017 年6 月，原國家食品藥品監督管理總局成為ICH 成員，進一步強調藥品科學監管與國際接軌，隨后專門成立了ICH 工作辦公室，主要負責ICH 指導原則的轉化實施。目前，國家藥品監管部門陸續發布多項ICH 指導原則及其中文譯稿，我國開始全面實施ICH 指導原則。2019 年，《S1A ：藥物致癌性試驗必要性指導原則》發布，成為第一個轉化的指導原則。2022 年，國家藥品監督管理局藥品審評中心發布了《關于公開征求ICH〈S1B（R1）：致癌性研究〉實施建議和中文版的通知》，持續推動新修訂的ICH 致癌性試驗指導原則在我國實施。綜上，本文對國內外致癌性試驗指導原則及指導用書進行了總結，見表1。
3、國內外致癌性試驗用遺傳修飾動物模型
遺傳修飾動物模型是建立藥物致癌性試驗替代方法的關鍵技術，對我國制藥企業而言，也是一項“卡脖子”的技術。為此，本文將重點介紹國內外代表性遺傳修飾動物模型的構建歷程、各自優缺點以及真實世界研究的應用，并對我國自主知識產權的致癌性小鼠模型的構建進行了討論。
3.1 國外遺傳修飾動物模型
20 世紀80 年代出現了轉基因技術，自此，通過基因編輯技術建立的遺傳修飾大小鼠模型廣泛用于各個領域，包括潛在致癌性試驗。常見的遺傳修飾小鼠模型包括Tg.rasH2 轉基因小鼠模型、p53+/- 基因敲除小鼠模型、Tg.AC 轉基因小鼠模型以及Xpa-/-基因敲除小鼠模型。
為驗證4 種替代小鼠模型的準確性和靈敏性，1996~2001年國際生命科學研究所（International Life Sciences Institute，ILSI） 和健康與環境科學研究所（Health and Environmental Sciences Institute，HESI）協調美國、歐盟和日本等國家和地區的50 多家制藥企業、政府部門和學術機構實驗室開展了小鼠模型的系統評估工作，耗費近3500 萬美元。通過標準化評定實驗方案，實現了跨多個實驗室獲得的數據的可重復性和可比性[27]。其間，共完成了包含N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）、p-3-氨基對甲苯甲醚、12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13等 21 個已知致癌受試物的致癌性實驗，雖然有個別實驗的結果不確定，但最終認為Tg.rasH2 轉基因小鼠模型和雜合p53+/- 基因敲除小鼠模型可用于短期致癌性試驗評價，Tg.AC 轉基因小鼠模型和純合Xpa-/- 基因敲除小鼠模型存在一定的試驗評價風險[28-29]。本文對國外常見的4 種小鼠模型的特性進行了比較，見表2。在2010 年后提交給FDA 的新藥申報中，未見采用雜合p53+/- 基因敲除小鼠模型用于致癌性試驗評價，目前使用最為廣泛的模型是Tg.rasH2 轉基因小鼠模型，故本文對Tg.rasH2 轉基因小鼠模型進行了重點介紹。
3.1.1 Tg.AC 轉基因小鼠模型
Tg.AC 轉基因小鼠模型是美國科學家Leder 等人在1990年構建，采用原核注射的方法將活化的人源v-Ha-ras 基因導入到FVB/N 小鼠品系中產生，該小鼠模型最顯著的特征是在表皮磨損區域或誘導后短期內會出現乳頭狀瘤， 曾用于經皮給藥藥物致癌性試驗的替代模型[30-33]。ILSI/HESI 項目中早期使用純合子Tg.AC 轉基因小鼠， 后期則使用雜合子Tg.AC 轉基因小鼠。Tg.AC 轉基因小鼠模型的構建，是將珠蛋白啟動子與v-Ha-ras 基因連接，通過傳統轉基因技術將重組DNA 隨機整合進入小鼠基因組。轉基因技術的天生不足可能會導致轉基因遺傳不穩定，基因可能會丟失，從而導致該小鼠對致癌物不敏感，不能較好地反映已知人類陽性致癌物的致癌性。早期Tg.AC 轉基因小鼠模型可用于局部給藥和用于人類局部使用的化合物的致癌性試驗，由于其準確性和敏感性方面缺陷，目前為其他模型取代，FDA 不再推薦使用這種模型 [34]。
3.1.2 Xpa-/- 基因敲除小鼠模型
Xpa-/- 基因敲除小鼠模型是美國科學家在1995 年構建，采用胚胎干細胞（embryonic stemcell，ES）打靶技術將小鼠Xpa基因的3–4 號外顯子敲除，從而獲得Xpa 基因敲除小鼠。Xpa-/-基因敲除小鼠易受紫外線誘導產生皮膚和眼部腫瘤，并可在二羥甲基丁酸化學誘導后發生皮膚腫瘤[35]。ILSI/HESI 項目中關于Xpa-/- 基因敲除小鼠模型數據較少，僅有13/21 個化合物采用該模型評價，且無重復試驗，特別是3 個人類遺傳毒性致癌物中的2 個化合物美法侖和環磷酰胺均未采用該模型進行評價，故尚無法對該模型的價值作出最終判斷，純合Xpa-/- 基因敲除小鼠與癌癥易感性增加最相關的是全基因組修復缺陷，而不是轉錄偶聯修復（transcription-coupled repair，TCR）缺陷。純合Xpa-/- 基因敲除小鼠存在TCR 介導的活性轉錄基因中基因毒性損傷缺陷，從而導致對化合物的敏感性增強，產生假陽性結果，故不推薦使用[34]。
3.1.3 p53+/- 基因敲除小鼠模型
p53+/- 基因敲除小鼠模型是美國科學家在1992 年構建[36]，采用ES 打靶技術敲除小鼠p53抑癌基因的5 號外顯子，通過顯微注射將重組ES 送入129 受體鼠的囊胚胚泡中，并將胚泡植入假孕的 F1（C57BL/6.CBA）雌性小鼠體內，產生嵌合型小鼠。嵌合體多表現為129 ES 遺傳特性，隨后將嵌合體雄性與 C57BL/ 6雌性小鼠交配。在第四代回交后，約有6% 的 129 品系等位基因被保留下來，故準確名稱應表示為B6.129-Trp53（N4）[37]。后續實驗發現，該模型對遺傳毒性致癌物敏感，僅可用于遺傳毒性藥物潛在致癌性試驗[28，38]，后續使用逐漸減少。
3.1.4 Tg.rasH2 轉基因小鼠模型
Tg.rasH2 轉基因小鼠模型是由日本科學家在1990 年通過轉基因方法將人原癌基因c-Ha-ras基因轉入小鼠篩選獲得，該轉入基因是通過將膀胱癌和黑色素瘤患者激活突變的c-Ha-ras 進行重組連接獲得， 僅最后一個內含子有突變， 保留c-Ha-ras 基因內源性啟動子和增強子， 如圖1 所示[39-41]。
另外， 該模型是在DBA/2 和C57BL/6J 小鼠品系的雜交胚中進行轉基因操作，產生并獲得了8 只首建鼠，其中2 只存活。初步比較后，最終選擇其中2 系作為模型的首建鼠，并將首建鼠與C57BL/6J 品系進行超過10 代的回交，使其與C57BL/6J 回交純度達到99.5%后開始大規模生產，目前使用的為C57BL/6J 品系的Tg.rasH2轉基因小鼠模型[42-44]。通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法證實，該模型一共轉入3 個拷貝基因，并在15 號染色體E3 區以首尾串聯方式排列[45]。為降低自發腫瘤發生率，實際致癌性試驗使用的是Tg.rasH2轉基因小鼠與BALB/cByJ 小鼠的雜交一代，命名為CB6F1 雜合小鼠。Tg.rasH2 轉基因小鼠和非轉基因同窩小鼠的生長曲線，如圖2 所示， 其中雄性Tg.rasH2轉基因小鼠的絕對體重為野生的80%， 雌性Tg.rasH2 轉基因小鼠的絕對體重為野生的 90%，但臟體比與野生型相似[46]。
值得一提的是，Tg.rasH2 轉基因小鼠模型是隨機插入方式構建，插入到E3 位點、插入3 個拷貝、呈首尾串聯方式排列，均是在生物體內自發發生的隨機事件。但這些因素均會影響轉基因的表達和模型穩定性，對后續該小鼠模型致癌性表型起到了不可忽視的決定性作用。再次重復這個轉基因過程，很難重現同一結果。
本文對 12 項 ILSI 替代致癌性測試（ACT）研究項目在 26周用藥期（32 周齡小鼠）內觀察到的自發性腫瘤發病率和發病時間情況進行了匯總，見表3。在多數情況下，常見自發性腫瘤的發生率略高于 1.0%[47]。2012 年，美國輝瑞公司等3 家公司根據內部數據和出版文獻等資料整理了Tg.rasH2 轉基因小鼠自發性腫瘤發生率。自發性腫瘤發生率大于1.0% 的常見腫瘤中，細支氣管肺泡腺瘤（平均3.9%~9.9%，范圍0.0%~18%）、細支氣管肺泡腺癌（ 平均1.4%~2.4%， 范圍0.0%~5.0%）， 脾臟血管肉瘤（ 平均3.0%~ 3.9%， 范圍0.0%~17.0%）， 皮膚鱗狀細胞乳頭狀瘤（ 平均1.1%~1.2%，范圍0.0%~ 4.0%）、哈德腺腺瘤（ 平均0.8%~1.2%， 范圍0.0%~4.0%） 和肝細胞腺瘤（ 平均1.8%， 僅雄鼠為0.0%~9.0%）[48]。總之， 該自發性腫瘤發生率在可以接受的范圍內，但也應注意，不同實驗室獲得的數據存在差異，甚至波動很大。此外，應注意不同實驗室間自發性腫瘤計算方法的差別，比較嚴格的方法是，不分腫瘤類型，只要有一只小鼠發生任何一種自發性腫瘤，均記為陽性。
陽性致癌物證實了Tg.rasH2轉基因小鼠對遺傳毒性和非遺傳毒性的人類致癌物是敏感的，能識別廣譜致癌物。根據傳統2 年期的嚙齒類動物的生物試驗數據，在對于27 種化學品進行的26 周分析研究中，Tg.rasH2 轉基因小鼠模型準確預測了約80% 化學品的致癌反應。以MNU（75mg/kg，腹腔注射） 作為陽性對照物（MNU 是最常用的陽性致癌物），Tg.rasH2 轉基因小鼠對陽性致癌物比同窩野生型小鼠更敏感的靶器官包括血液系統、胸腺、前胃和皮膚[46，49-50]。近幾年，Tg.rasH2 轉基因小鼠的研究趨于細化，多數研究集中在其背景腫瘤的研究，以期增加該小鼠模型的背景數據庫，提升試驗的準確性。根據美國輝瑞公司2004 年3 月和2009 年7 月在GLP 條件下進行的10 項雄鼠和11 項雌鼠為期6 個月致癌性研究，研究結果結合其他研究和文獻報道，較全面匯總了Tg.rasH2 轉基因小鼠的腫瘤譜及發生率，見表4。
3.2 我國遺傳修飾動物模型
目前， 我國通過GLP 認證的藥物非臨床安全性評價研究機構已70 多家，建立了較為系統和完善的藥物臨床前安全性評價體系，但臨床前藥物致癌性試驗體系的建立尚滯后于國外，缺乏我國自主知識產權的致癌性小鼠模型。從2004 年開始，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）啟動了我國自主知識產權的致癌性小鼠模型研究，先后研發了基于傳統轉基因技術構建的Tg.C57- ras V1.0 版和先進干細胞打靶技術構建的KI.C57- rasV2.0 版兩代致癌性小鼠模型，均已獲得專利授權，并在國內較廣泛地使用。由于起步工作基礎薄弱，研發過程曲折，且研究經費需求巨大，項目整體進展未達到預期，研發經歷了長達數十年。本文將簡述中檢院兩代致癌性小鼠模型構建歷程，總結得與失，并提出建立我國自主知識產權的致癌性小鼠模型需要著重考慮的要點，以期為后續研究人員研發提供參考。
3.2.1 中檢院一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型
中檢院一代致癌性小鼠模型采用與日本Tg.rasH2 轉基因小鼠模型相同的轉基因方法構建，命名為Tg.C57-ras V1.0，轉入的人原癌基因c-Ha-ras 含有4 個外顯子、自身啟動子、調控序列和poly A 信號序列[51]。經原核注射，轉基因整合率為1.6%，獲6 只首建鼠，其中3 只成活，最終選擇首建鼠3 進行保種繁殖，后續實驗證明，其轉基因能穩定遺傳[52]。插入基因拷貝數經熒光定量PCR方法測定，拷貝數為4[53]，但整合位點未確定。
通過測定Tg.C57-ras V1.0小鼠的22 項血液生理指標和12項血液生化指標，比較雌性轉基因陽性鼠和陰性鼠發現，嗜中性粒細胞（NEUT）、嗜中性粒細胞百分比（NEUT%）差異顯著（P<0.05） ，血小板壓積（PCT）差異極顯著（ P<0.01），其余19項無顯著性差異（P>0.05）。雌性陽性鼠和陰性鼠的12 項生化指標均差異不顯著（P>0.05）；雄性小鼠丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、甘油三酯（TG） 差異顯著（P<0.05），其余10 項差異不顯著（P>0.05）[54-56]。
給予Tg.C57-ras V1.0 小鼠陽性致癌物（MNU，75mg/kg），雌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠惡性淋巴瘤的發生率為14%，比相關文獻報道略低，未觀察到皮膚及前胃乳頭狀瘤等特征腫瘤的發生[57]，雌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠乳腺腺瘤的發生率為6%，但是雄性Tg.C57-ras V1.0 小鼠發生直腸纖維肉瘤，未見相關文獻報道。
結合后續數量更大且多單位使用結果顯示， 一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠較同窩野生型敏感，遺傳穩定性好，質量可靠。目前，累計向市場提供近1500 只，用于硝酸鑭、納米銀新型材料的潛在致癌性試驗，并支持國家科技重大專項項目完成，推動了我國基于轉基因小鼠模型的致癌性試驗替代方法的建立[58-59]。
通過對不同單位的5 個致癌性試驗時間綜合分析及文獻對比發現， 一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型存在較突出的不足，主要表現為敏感性較日本Tg.rasH2 轉基因小鼠低，尚不能完全達到文獻報道的國際同類模型的效果。這可能是由于轉基因技術本身的局限性或其他原因帶來的，故在2017 年前后，中檢院停止了一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型的生產供應，并同步啟動更加先進的第二代致癌性小鼠模型的研制。
基于多年的探索，雖然一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型存在局限，但為研究人員在致癌性小鼠模型研究中積累了豐富的數據和經驗，為二代小鼠模型的遺傳設計、生物學特性鑒定、生產體系及資源保存體系的建立以及規模化聯合驗證思路的形成奠定了基礎。同時，也提示了研究人員基于常規轉基因技術構建的遺傳修飾小鼠模型較難達到預期效果。
3.2.2 中檢院二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型
基于遺傳學原理及遺傳修飾小鼠模型的自身特點，研究人員認為遺傳修飾動物模型的表型受5 方面因素影響：轉基因、轉基因拷貝數、基因排列順序、插入位點以及小鼠遺傳背景，要想獲得符合預期的表型，上述因素均需要考慮。中檢院二代致癌性小鼠模型，是在總結一代致癌性小鼠模型經驗與不足的基礎上，充分考慮上述影響因素后而設計的。鑒于常規轉基因技術存在局限，二代致癌性小鼠采用了全新的ES打靶大片段定點整合技術。
中檢院二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型， 是將3 個拷貝的人源c-Ha-ras 全長基因組DNA 首尾串聯， 精準插入C57BL/6J 小鼠15 號染色體E3位點（15E3） ，經過多重篩選而得，其基因結構圖如圖3 所示。插入的DNA 全長片段約為21 kb，由于該原癌基因鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC）偏高，且含有重復序列，要實現定點整合的操作難度很大，構建需花費較長時間。二代致癌性小鼠模型名稱中，“KI” 是“Knock-in” 的縮寫，意指定點插入，與一代致癌性小鼠模型表示轉基因的“Tg”（transgenic）不同，轉基因一般為隨機插入，容易導致基因丟失，遺傳不穩定；“C57” 表明其遺傳背景，即直接采用C57BL/6JES 進行編輯，無需漫長回交直接獲得純C57BL/6J 背景的模型；“ras”意指插入的基因為人源原癌基因c-Ha-ras，不包含突變位點；二代致癌性小鼠模型具有明顯的優勢，即遺傳穩定、個體間均一，結果一致性更好。實際表型驗證數據結果也表明，二代致癌性小鼠模型敏感、遺傳穩定、表型優良，為構建我國自主知識產權的致癌性小鼠模型奠定了基礎。二代致癌性KI.C57-rasV2.0 小鼠模型較中檢院一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型及Tg.rasH2 轉基因小鼠具有優勢，這得益于其采用了先進的ES 打靶技術，實現定點整合。
測定二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型的22 項血液生理指標和9 項血液生化指標結果顯示，轉基因陽性雌鼠、雄鼠和同窩陰性雌鼠、雄鼠相比各項指標沒有差異，均在正常值范圍內；9項血液生化指標也無差異。這意味著二代致癌性小鼠模型血液生理生化指標背景清晰干凈，有利于在藥物安全評價中的應用。
經過給予MNU 致癌物驗證，結果提示二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型能形成淋巴瘤、鱗狀細胞癌、鱗狀細胞乳頭狀瘤、腺癌、腺瘤等腫瘤。值得注意的是，在特征性靶器官例如前胃和皮膚，能觀察到典型腫瘤類型，包括鱗狀細胞乳頭狀瘤和鱗狀細胞癌，且比例明顯高于野生型小鼠，組織病理學特征分析結果也與相關文獻報道特征一致。另外，給予MNU 后，小鼠首次死亡時間、期末生存率及腫瘤發生率及關鍵特征靶器官與同窩陰性小鼠有明顯差異。通過對50 只小鼠為期6個月的自發性腫瘤觀察，發現僅1 只小鼠在6 個月內出現了脾淋巴瘤，表明自發性腫瘤發生率低，但目前尚缺少大規模觀察數據。
自二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型研發成功以來，得到業界廣泛關注。2020 年9 月，在北京召開了人源化小鼠模型研究進展研討會，會上專家、學者聽取了致癌性模型的構建過程及驗證結果，并一致支持推動這一具有自主知識產權且彌補國內短板的模型動物的國產化[60]。截至目前，中檢院已經向我國10余家制藥企業提供了二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型， 用于新藥評價、致癌性試驗平臺建設及食品添加劑、醫療器械、生物大分子的潛在致癌性試驗。在獲得國家藥品監督管理局GLP 認證的20 家機構中，有7 家使用過二代致癌性KI.C57-ras V2.0小鼠模型。通過對已經完成致癌性試驗機構的數據進行分析表明，在給予MNU 后二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型的首次死亡時間，期中和期末生存率、腫瘤發生率（100%）、腫瘤譜（腫瘤類型）及關鍵特征靶器官比較一致，表明該模型不僅較同窩陰性小鼠具有更高的致癌敏感性，可重復性好，且與ILSI 的ACT研究項目中所涉及的日本致癌模型的 MNU 誘導后產生的致癌實驗評價指標相同或接近，但數據量有待進一步充實。這些已有數據表明，二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型較一代質量大幅度提升，對致癌物敏感，具備作為標準動物模型用于藥物臨床前致癌性試驗的潛力。
3.2.3 其他致癌模型
我國多家相關企業或機構也研發了同類致癌性小鼠模型。據公開資料顯示，北京維通達生物技術有限公司構建的CB6F1-Tg（HRAS）9/Vst 小鼠（ 以下簡稱rasH 小鼠）采用轉基因方法構建[61]，轉入基因包含人原癌基因的編碼序列、內含子以及上下游非編碼區的染色體DNA 片段。將DNA 片段注射到C57BL/6N小鼠受精卵的原核內，獲得轉基因陽性首建鼠，分別擴繁建系，進行表型分析，從中篩選符合致癌性試驗的第9 個系保留。用數字定量PCR 法確定該小鼠串聯轉基因拷貝數4 個，用染色體步移法確定轉基因串聯片段，并整合于小鼠第6 號染色體上。利用免疫印跡法進行檢測，結果顯示HRAS 在小鼠前胃和肺中具有較高的表達量。江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司采用了轉基因技術，將人原癌基因Hras 進行基因改造后，連同內源性啟動子和增強子轉入B6 小鼠體內，命名為B6J-Tg（hHRAS）16/Gpt轉基因小鼠，即Tg（hHras） [62]。本文根據公開數據對上述幾種小鼠模型進行了特征比較，見表5。
4、藥物致癌性試驗替代方法的建立
4.1 藥物致癌性試驗替代方法建立的必要性
目前，國內外均廣泛采用并接納ICH S1B 致癌性試驗設計框架，采用2 年期大鼠試驗加上6個月遺傳修飾動物試驗的評價已經成為支撐新藥申報的主流數據。致癌性小鼠試驗因其實驗周期短、結果準確可靠、受自發性腫瘤干擾小的突出優勢，越來越受到制藥行業的重視[63]。
自“ 十三五” 以來， 我國著眼從制藥大國向制藥強國邁進。據《自然》（Nature） 雜志發表的評述文章[64]， 近年來，我國創新藥首次新藥臨床試驗（investigational new drug，IND） 申請的數量急劇增加。2010~2020 年， 國家藥品監管部門共收到了1636 件創新藥的首次IND 申請，86% 來自國內的制藥企業。2023 年， 我國Ⅰ類新藥申請1310 件，同比增加近34%。其中，中藥60 件，同比增加33% ；創新化學藥品626件，同比增加35% ；創新生物制品624 件， 同比增加32%。不難看出，我國創新藥在迅速發展，而新藥的臨床前致癌性試驗需求必然隨之提升。
然而，目前致癌性試驗小鼠資源來源唯一，且該模型進口成本逐年上漲，由于致癌性試驗單次動物用量大，購買動物的成本占比不容小覷。此外，供應鏈問題還會受到其他因素的影響，制約了我國制藥企業的發展。我國制藥企業十分期待質優價廉國產致癌性小鼠模型。
4.2 中檢院建立致癌性試驗替代小鼠模型的歷程
2004 年開始，中檢院開始組建遺傳修飾動物模型平臺，隨即開啟自主知識產權的致癌性小鼠模型研究。如前所述，先后研發了一代致癌性Tg.C57-ras V1.0小鼠模型和二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型，分析了模型的生物學特性，建立了胚胎冷凍及精子冷凍資源保存方法和規模化生產及供應技術，組織開展了多批次驗證實驗，并發表了一系列成果論文，獲得了多項專利授權，還先后向相關企業提供大批模型動物，為推動我國致癌性試驗替代方法的建立發揮了主力作用。
4.3 建立我國致癌性小鼠模型的幾點思考
質量可靠、經過充分驗證且能穩定批量供應的致癌性小鼠模型是建立我國致癌性試驗替代方法的關鍵技術。第一，致癌性小鼠須具備清晰的遺傳背景，從打靶載體設計到完成構建，均需充分論證。第二，要對其生物學特性進行充分細致地分析，闡明轉基因拷貝數、整合位點、序列等特征。第三，需要充分驗證致癌性小鼠模型的敏感性和準確性，必要時可開展多中心聯合驗證，并建立質量標準[65-67]。第四，建立對種質資源進行胚胎和精子冷凍保存，以確保模型供應的一致性。第五，需要建立穩定的批量生產體系和質控體系（圖4）。第六，需要關注致癌性小鼠模型的自發性腫瘤發生率、生理生化參數背景數據，以保障小鼠模型質量。
4.4 我國自建致癌性小鼠模型與國際致癌性小鼠模型的關系
國際上Tg.rasH2 轉基因小鼠的構建大體上經歷了模型構建與生物學特性研究、多實驗室聯合驗證、專家討論認可3 個階段。聯合驗證是關鍵環節，旨在證明轉基因陽性小鼠較同窩野生型小鼠易感，證明小鼠模型的準確性與靈敏度。我國自建致癌性小鼠圖4 中檢院致癌性小鼠模型的資源保存、生產和供應體系模型同樣離不開上述環節，但由于目前研究人員已積累了大量背景數據，充分認可基于遺傳修飾動物模型開展致癌性試驗結果，故無需像Tg.rasH2 轉基因小鼠模型，開展幾十種致癌物的驗證實驗。只需在遺傳基礎清晰前提下，開展充足數量的驗證，證明自建模型的可靠性即可。但需要考慮，我國自建的致癌性小鼠模型的表型需要與Tg.rasH2 轉基因小鼠比較，因為腫瘤發生本身是一個復雜的過程，受模型動物的影響，同樣受致癌性試驗和統計學方法的影響。
綜上，從支持我國新藥研發角度出發，建立具有我國自主知識產權的致癌性小鼠模型是必要而緊迫的。建立模型，需充分研究其生物學特性，建立資源保存和生產體系，開展聯合驗證，獲得必要的背景數據，以推動業界及監管機構認可，是建立致癌性小鼠模型的必然途徑。雖然建立我國自主知識產權的致癌性小鼠模型尚有待大量工作需要完成，但我國定會突破重重困難，實現致癌性小鼠模型的國產化。
來源：中國食品藥品監管雜志
