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【導(dǎo)讀】在教科書和文獻上常常用到檢出限這個概念，但說法五花八門，如，最常見到有：檢出限、檢測限、最低檢出限、最低檢測濃度、定量限、定量下限、最低定量濃度、測定限、儀器檢出限、方法檢出限、樣品檢出限等，聽起來云里霧里，容易被混淆，有必要進行一個梳理。這里最主要的是兩個概念，目前已經(jīng)基本達成共識：檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。

1 基本概念

     檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導(dǎo)原則中規(guī)定這2項是重要的驗證指標，包括定量、限度的雜質(zhì)測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導(dǎo)原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。本文試圖從定義、測量方法、問題和解決方案進行簡單的討論，為分析方法驗證活動中檢測限和定量限的的開展提供一定的參考。 

檢測限（limit of detection，LOD）

     指試樣中被測物能被檢測出的最低量或最低濃度，也叫檢出限。能以適當?shù)闹眯哦缺粰z出的組分的最小量或最小濃度，檢測限是我們判斷被分析物是否存在的含量水平即有無的判斷。

定量限（limit of quantification，LOQ）

     指試樣中被測物能被定量測定的最低量或最低濃度，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準確度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。

2  測定方法
     檢測限和定量限的測量方法有直觀法、信噪比法、基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法等3種方法，不同方法應(yīng)用范圍有所不同：
   （1）直觀法主要用于非儀器方法，通過目視法觀察逐級稀釋進樣獲得非儀器方法檢出限（或定量測定）的最低濃度或量。
   （2）信噪比法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法，是通過已知低濃度的被測物的檢測信號與基線噪音比較，確定可被檢測出的最小量或濃度。檢測限一般以信噪比為3:1或2:1；定量限一般以信噪比為10:1。
   （3）基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法可采用已知標準物質(zhì)與空白樣品，或已知含量的樣品在低濃度范圍按照分析步驟進行測量，通過分析相當數(shù)量的樣品（需要12~20份）計算方法的檢出限和定量測定最低濃度或量，其計算公式為（公式1）：LOD（LOQ）=3.3（或10）δ/S  
     式中：LOD（LOQ）：檢測限（定量限）；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：（1）測定空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。

      ICH于1996年在分析方法驗證指導(dǎo)原則中規(guī)定了基于響應(yīng)值的標準偏差和標準曲線斜率計算檢測限與定量限的方法，隨后USP與EP均收錄了該方法，《中國藥典》2015年版通則9101中首次收錄了該方法，按照LOD=3.3δ/S(LOQ=10δ/S)公式計算，其中δ為響應(yīng)值的偏差，S為標準曲線的斜率，較為簡便的方法是采用對照品或已知含量的樣品在低濃度范圍內(nèi)制備系列濃度的線性溶液，按分析步驟進行測量，繪制濃度-峰面積線性回歸曲線計算檢測限與定量限，以某品種為例，見表1。

表1  基于響應(yīng)值的標準偏差和標準曲線斜率計算檢測限與定量限示例

     通常是在同一張色譜圖中，選取比較平滑的一段基線計算噪音水平，如此，可能因為基線選取段的不一樣導(dǎo)致檢測限(定量限)產(chǎn)生較大差異，可采用隨行空白的方法進行信噪比的計算。《中國藥典》2015年版通則9101明確應(yīng)把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，以目標峰出峰時間附近空白色譜圖中的噪音進行計算。

3 檢測限和定量限的常見問題

      由于使用上的方便性，信噪比法是目前方法驗證中最常用的測量方法。但信噪比受檢測儀器狀態(tài)的影響很大，且與耗材、試劑、樣品前處理等多種因素相關(guān)，按信噪比3/10計算與驗證過的檢測限/定量限在下一次檢測時并不是方法的檢測限/定量限，因此導(dǎo)致方法驗證出現(xiàn)異常，測量的定量限（檢測限）并不是真正的方法定量限，特別是定量限可能不能滿足精密度和準確度要求，即定量限測不準原理。

     信噪比法測量檢測限和定量限的主要問題在于其本質(zhì)上也是一種直觀測量的方法，主要用于儀器檢出限的測量和判斷。而儀器檢出限（對于復(fù)雜的系統(tǒng)更應(yīng)該稱為系統(tǒng)檢出限）則受到由整個檢測系統(tǒng)性能的影響（如高效液相法由HPLC儀器、色譜柱、流動相、檢測器共同組成），其是一個動態(tài)的結(jié)果。當一臺經(jīng)確認的儀器（完成安裝確認IQ、設(shè)計確認DQ、運行確認OQ）在分析實驗室運行后，其性能必須經(jīng)過定期的性能確認PQ，或者按計量規(guī)程進行校準，確定其整機性能如儀器檢出限等符合性能標準。如在JJG 705-2014液相色譜儀檢定規(guī)程中，其最小檢測濃度即儀器檢出限的方法即信噪比法，通過進樣低濃度的標準溶液，再根據(jù)標準溶液峰高和基線噪音峰高的比值計算。

     由此可知，信噪比法反映出的是方法驗證當時狀態(tài)下系統(tǒng)檢出限/定量限，而非對于方法的檢測限/定量限，在實際使用不能盲從于信噪比3/10的結(jié)果。如作者以前在進行一個工藝相關(guān)雜質(zhì)檢測HPLC分析方法驗證時，根據(jù)信噪比法計算的檢測限位1μg/ml、定量限為3μg/ml（驗證中S/N均大于10、均值在15左右），因此制定方法的標曲下限為5μg/ml，但在色譜柱使用幾個批次之后，發(fā)現(xiàn)標曲下限5μg/ml的S/N就已經(jīng)掉到10以下了，此時原檢測限的S/N肯定也有著很大的變化，完全沒有達到方法驗證中檢測限、定量限驗證的目的。

4 檢測限和定量限的解決方案

    因為檢測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10，但當達不到該要求時，只要規(guī)定定量限比ICH規(guī)定的雜質(zhì)報告限低即可（如50%報告限）。

    按照檢測限和定量限的常用測量方法如信噪比法的結(jié)果并不準確，其僅能反映在當前條件下的儀器（系統(tǒng)）檢出/定量限。因此在分析方法驗證中，不能簡單地以信噪比3/10進行判定和驗證測限和定量限，而應(yīng)該根據(jù)標準限度和相關(guān)法律法規(guī)，綜合考慮分析方法的靈敏度要求，并可以在分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準。