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嘉峪檢測網 2020-11-28 17:42
一、前言
遺傳毒性雜質（Genotoxic Impurities，GTIs），也稱基因毒性雜質，是指能引起遺傳毒性的雜質，包括致突變雜質和其他類型的非致突變雜質。其中，致突變雜質（Mutagenic Impurities）指在較低水平時也能直接引起DNA損傷，導致DNA突變，從而可能引發癌癥的遺傳毒性雜質[1]，其致突變致癌作用機制目前一般認為是線性機制。致突變性(Mutagenicity)通常由標準的細菌回復突變試驗（Ames試驗）結果判定，致癌性（Carcinogenicity）由動物致癌試驗結果和人類致癌性相關證據判定。非致突變性遺傳毒性雜質不直接作用于DNA，一般引起染色體畸變，通常為閾值機制，即化合物劑量與效應之間的關系不完全是線性的，在濃度達到一定閾值后才產生相應的毒性作用。閾值機制的存在可能是化合物在與DNA接觸前即被降解失活，或產生的損傷一定程度內可被有效修復[2]。隨著科學研究的深入，逐步發現閾值機制在非致突變（如苯胺）和致突變（如甲磺酸乙酯EMS）致癌物中都存在。閾值機制在《Genotoxic Impurities：Strategies for Identification and Control》[3]一書第7章節有詳細闡述。ICH M7和中國藥典2020版四部通則9306均關注致突變機制的遺傳毒性雜質，非致突變機制的遺傳毒性雜質以一般雜質水平存在時，通常可忽略其致癌風險。
二、法規發展歷程
自2000年起，藥監機構相繼發布相關文章或指導原則，要求原料藥和制劑廠商對遺傳毒性雜質進行風險控制。如下為主要的法規發展歷程：
2000年，歐洲藥典公開發表文章，提出磺酸在醇溶液中成鹽可能產生磺酸酯類雜質；
2002年，CPMP（Committee for Proprietary Medicinal Products, 歐洲專利藥品委員會），現為CHMP（Committee for Human Medicinal Products，人用藥品委員會），發布《Position paper on the limits of GIs》，提出閾值機制和線性機制，需要對遺傳毒性雜質進行質量（Quality）和安全性（Safety）評估；
2004年， 《Guideline on the Limits of GIs-draft》發布，提出ALARP（As Low As Reasonably Practical，合理可行的最低程度）原則和TTC (Threshold of Toxicological Concern，毒理學關注閾值)概念；
2006年，PhRMA（Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，美國藥品研究和制造商協會）發布白皮書，提出分期TTC（Stage TTC）概念，并將遺傳毒性雜質分為5類，將定量構效關系（Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR）評估作為遺傳毒性雜質風險評估的第一步；
2006年，EMA發布首個正式指南《Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities》，2008年由CHMP安全工作組（SWP）發布Q&A，提出決策樹；
2008年，FDA發布《Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substance and Products: Recommended Approach》；
2017年，ICH發布指南《M7(R1) Assessment and Control of DNA Reactive(Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic》；
2020年，中國藥典2020版四部通則9306 遺傳毒性雜質控制指導原則隨藥典發布正式公開。
隨著相關科學研究的深入，已發布的指南也會逐步優化調整，繼續協調企業與監管機構之間的不同意見。
三、風險評估過程
遺傳毒性雜質的研究是綜合學科，涉及有機化學（產生和清除機理）、生物化學（致突變致癌機理）[4]、毒理學（體內體外遺傳毒性試驗、致突變和致癌性數據評估等）、計算機分子模擬（軟件預測）、制藥工藝（合成路線篩選、遺傳毒性雜質的工藝控制等）、分析化學（產品檢測）等；因此，在ICH指南中不屬于Q3系列，歸類在M系列下（Multidisciplinary Guidelines）。原料藥或制劑產品中遺傳毒性雜質的風險評估過程也會涉及上述各學科知識。同樣的，監管機構審評過程中涉及到非臨床安全性數據（實驗數據、計算機預測數據及相關文獻可靠性評估、AI和PDE計算等）部分由藥理毒理專業審評；確定AI或PDE后，結合每日最大給藥劑量和用藥周期確定的限度、相關的分析檢測方法學和工藝控制策略由藥學專業審評。
對遺傳毒性雜質進行風險評估時，需考慮到產品所處的不同開發階段。處于臨床I期的產品和申報上市的產品，在遺傳毒性雜質的工藝控制、限度確定、檢測方法開發等要求上是不同的，大致可按如下風險評估流程進行：
第一步，列出產品工藝路線中的所有可能雜質，不限于起始物料、中間體、試劑、催化劑、溶劑、可能的反應副產物（尤其是最后一步反應）、降解產物（來自強制降解、長期和加速穩定性試驗、制劑工藝過程或原輔料相容性試驗）等；代謝產物和制劑降解產物需要另行考慮，這些雜質大部分時候也是中間體或起始物料，在原料藥合成路線設計時就需要考慮到可能產生遺傳毒性雜質的代謝途徑和降解途徑，并盡量避免。代謝產物和制劑降解產物的研究控制在《Genotoxic Impurities：Strategies for Identification and Control》[3]一書第6章節和第15章節有詳細闡述，此處不再贅述。
第二步，采用數據庫/文獻檢索、QSAR評估、體外遺傳毒性試驗（通常是細菌回復突變試驗）、體內遺傳毒性試驗等方法對上述化合物進行遺傳毒性結構評估；充分利用可靠文獻和軟件預測進行評估，盡量減少動物試驗。按照標準流程進行的細菌回復突變試驗需要至少300mg各化合物，某些難以獲得的雜質用于該試驗可能比較困難。基于結構的評估可以有效預測細菌回復突變試驗結果，即上述的可靠的文獻檢索（致癌性和致突變性毒理學數據）和QSAR評估。
1）文獻檢索
可靠的化合物致癌性和致突變性毒理學文獻檢索首先來源于可靠的數據庫或專業網站上經過各學科專家組織充分評估過的與普通人群暴露（食物、水、空氣等）相關的安全性數據。遺傳毒性雜質在藥學領域是較新的概念，但是相關化合物在環保、化學危險品、人類健康等領域已有多年毒理學研究數據積累。以下是常用的數據庫或檢索網站：
IARC（International Agency for Research on Cancer，國際癌癥研究署）是世界衛生組織下屬的一個跨政府機構，進行世界范圍內的癌癥流行病學調查和研究工作，從1971年起組織專家組收集和評價世界各國有關化學物質對人類致癌危險性的資料，其分類網站（https://monographs.iarc.fr/list-of-classifications）定期更新化合物致癌性分類，最新的分類標準詳見表1。該分類與遺傳毒性雜質的分類不同，只針對致癌性進行分類，ICH M7中的遺傳毒性雜質基于致癌性和致突變性進行分類。
表1 IARC化合物致癌性分類
| 類別 | 定義 | 分類標準 |
| 1類 | 對人具有致癌性 | 有足夠的證據證明對人類具有致癌性；人類暴露有強有力的證據，同時在實驗動物中顯示出重要的致癌物特征和足夠的致癌性證據。 |
| 2A類 | 對人很可能是癌 | 進行至少兩次下列評價，包括至少一次涉及人體和人體細胞或組織的評價:1.人類致癌性證據有限；2.實驗動物有足夠的致癌證據；3.強有力的證據顯示具有致癌物質的關鍵特征；這類物質或混合物對人體致癌的可能性較高，在動物實驗中發現充分的致癌性證據，對人體雖有理論上的致癌性，但實驗性的證據有限。 |
| 2B類 | 對人可能致癌 | 該類別存在下列評價之一的情況:1.人類致癌性證據有限；2.動物實驗中有足夠的致癌證據；3.強有力的證據表明具有致癌物關鍵特征(無論是暴露于人類還是人體細胞)。 |
| 3類 | 對人的致癌性尚無法分類 | 不屬于以上任何類別的因素通常被放在這個類別中。當在動物實驗和人類致癌性證據均不足時，通常放在此類別；當有強有力的證據表明在實驗動物中有致癌性機制但不能在人類身上起作用，在人類身上的證據還不夠時，也可放在此類別中。 |
ToxInfo（毒理學數據網絡，https://www.toxinfo.io/）是美國國立醫學圖書館（National Library of Medicine, NLM）建立的門戶網站，由涉及毒理學、危險化學品、環境衛生等相關領域的數據庫構成，由NLM的專業信息服務部執行的毒理學和環境衛生信息計劃來管理。ToxInfo提供了對下列數據庫的免費訪問檢索：HSDB、ChemIDplus、CTD、CPID、Haz-Map、IRIS、ITER、CCRIS、CPDB、GENE-TOX。其中我們常用的是CPDB、IRIS、CCRIS、GENE-TOX、HSDB、ITER。
CPDB(Carcinogenic Potency Database，致癌性數據庫)，由加利福尼亞大學和勞倫斯伯克利實驗室開發，收錄了自1950年代以來進行的6540項慢性、長期動物癌癥實驗結果的標準化分析，只提供1980~2011年間的信息，現已不再更新。CPDB收錄的毒理學數據（鼠傷寒沙門氏菌Ames試驗結果、不同種屬動物的TD50等）被各國藥監機構廣泛認可，可直接使用，一般選擇最低的TD50值進行AI（Acceptable Intakes，可接受攝入量）值計算。
IRIS（Integrated Risk Information System, 綜合風險信息系統）是美國環境保護署（Environmental Protection Agency, EPA）開發的一個人類健康評估計劃，評估暴露于環境污染導致對于健康的影響（癌癥和非癌癥）的情況，收錄的化學品信息都經過了EPA科學家們的審定，并代表了EPA的結論性意見。IRIS除了對特定化合物的不同致癌性和致突變性毒理學試驗結果進行專業評估匯總，也會提供明確的用于計算參考劑量（Reference Dose, RfD）的NOEL（No-Observed Effect Level，未觀察到作用水平）、NOAEL(No-Observed Adverse Effect Level，未觀察到有害作用水平)或LOEL（Lowest-Observed Effect Level，觀察到作用的最低水平）、相應于1/100000風險水平的飲用水限度或吸入劑量等數值，可用于計算可接受攝入量，權威性和認可度較高。
CCRIS（Chemical Carcinogenesis Research Information System，化學致癌研究信息系統）由美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）開發和維護，收錄了9000多種致癌性、致突變性、誘發腫瘤和抑制腫瘤的試驗結果的化學品記錄，只提供1985~2011年間的信息，現已不再更新。CCRIS羅列文獻發布的致癌性和致突變性簡單試驗過程和試驗結果（陰性或陽性），未提供直觀的TD50、NO(A)EL、LOEL等數據，這些試驗結果經常不一致，需要專業的毒理學人員對試驗過程合理性進行判斷，質量研究人員只能參考。
GENE-TOX(Genetic Toxicology Data Bank, 遺傳毒理學數據庫)由美國環境保護署創立，收錄3200多種化學品的經專家審評的遺傳毒理學試驗（含致突變性）結果，只提供1991~1998年間信息，現已不再更新。同CCRIS一樣，只羅列簡單的動物試驗結果，僅供參考。
HSDB（Hazardous Substances Data Bank, 危險物質數據庫）收錄了5800多種危險化學品的毒理學數據，提供了充分的參考文獻，并且經過科學審查小組的評審。Section 5下提供的毒理學試驗總結中也能找到NO(A)EL、LOEL值，可靠性上可能不如IRIS提供的結果，僅供參考。
ITER（International Toxicity Estimates for Risk，國際毒性風險評估）提供來自全球各權威機構的600多種環境關注化學品的健康風險值和癌癥分類，用表格形式對比不同機構（CDC/ATSDR、Health Canada、RIVM、 US EPA、IARC、NSF International等）的數據差異，并作出解釋，提供來源文獻和更詳細的說明鏈接。我們可以在這個數據庫中找到化合物的各類權威毒理學試驗結果，并直觀看到數據比較，最終選擇哪個數據進行限度計算還需要專業毒理學人員充分合理評估。
ToxInfo提供的上述數據庫，沒有毒理學專業知識的質量研究人員用的比較多的還是CPDB和IRIS，能獲得直觀的TD50計算AI或NO(A)EL等計算PDE。
其他可靠網站和數據庫還有：Carcinogenicity Database (Lhasa Ltd.)、ATSDR、IPCS、CalEPA、NTP等。
Carcinogenicity Database（https://carcdb.lhasalimited.org/carcdb-frontend/）由Lhasa Ltd.公司開發，提供比CPDB更加詳細的TD50值獲得的試驗過程。Lhasa Ltd.公司也開發了Derek、Meteor、Vitic和Zeneth等預測軟件，其中Derek被藥監機構廣泛認可。
ATSDR（Agency for Toxic Substances & Disease Registry，有毒物質和疾病登記局）是美國健康和公共服務部門下屬的聯邦公共健康機構，預防與有毒物質有關的有害暴露和疾病，提供經專家小組評估過的毒理學數據匯編（Toxicological Profiles），該網站下（https://www.atsdr.cdc.gov/mrls/mrllist.asp#169tag）定期更新有毒物質的不同給藥途徑下的急慢性動物試驗結果MRLs（Minimal Risk Levels，最小風險劑量）值，類似于EPA提出的參考劑量（RfD），是無健康風險的暴露劑量的估算值，具體是指人類在確定的時間內每日接觸有害物質而不產生明顯的非致癌性損害作用的劑量。該值可靠性高，可計算PDE值。
IPCS（International Programme on Chemical Safety，國際化學品安全規劃小組）由世界衛生組織、國際勞工組織和聯合國環境規劃署共同成立的有關化學品安全的國際合作機構，開展化學品對人體健康和環境風險的評價，包含動物試驗結果、人體和環境暴露及安全性評價，其網站也會公布特定化合物的CICAD（Concise International Chemical Assessment Document, 簡明國際化學品評估文件）及可接受攝入量（https://www.who.int/ipcs/publications/cicad/cicads_alphabetical/en/）,國際認可度高，可參考使用。
CalEPA（California Environmental Protection Agency, 加利福尼亞州環境保護局）提供毒理學試驗結果和直觀的口服或吸入斜率因子（Slope Factor）和NSRL（No Significant Risk Level，無顯著風險水平），可直接作為特定化合物的可接受攝入量。網址鏈接：https://calepa.ca.gov/，搜索欄中直接輸入CAS號即可。
NTP（National Toxicology Program，美國國家毒理計劃），提供各化合物的毒理學研究結果，網址鏈接：https://ntp.niehs.nih.gov/，搜索欄中直接輸入CAS號即可。
上述各數據庫或網址均是被國際廣泛認可的權威性安全性數據檢索來源，某些化合物相關研究較多，各網站均能提供相關毒理數據，此時需要對不同網站檢索到的毒理學數據進行試驗過程合理性評估，最好由毒理學專業人員進行。某些化合物所能檢索到的毒理學數據較少，當上述網站都沒有相關信息時，可嘗試在google中檢索“CAS號 EPA”，也能獲得US EPA公布的信息。
文獻檢索和結果分析需要一定時間，大量的英文文獻和毒理學專業術語可能有些費勁，對安全性數據的評估也需要毒理學專業人員參與，此時采用QSAR方法對化合物進行結構評估就顯得簡單一些。
2）QSAR評估
ICH M7推薦采用2種互補機理的QSAR毒性預測方法，如基于專家規則的Derek（Lhasa Ltd.開發， FDA、EMA推薦使用）、Compact、OncoLogic等；基于統計學的Sarah、Topkat (Accelrys Inc.)等。上述軟件的毒理學數據均是來自化合物實際Ames試驗結果，通過專家系統知識或已有的毒理學數據統計分析，建立模型對待測物進行毒性預測。軟件預測的靈敏度（sensitivity）和特異性(specificity)在苯胺或氮雜芳胺類遺傳毒性雜質的評估上有一定缺陷，不過會隨著實際化合物Ames試驗結果和更精準的警示結構的不斷補充逐步提高，使用者需特別關注這類雜質的評估結果。企業也可以采用自行開發的軟件進行毒性評估，但所采用的方法需遵循經濟合作與發展組織（OECD）制定的一般驗證原則[5]，且應使用2014年M7發布之后開發的模型進行預測。
如果經2種互補的QSAR方法預測均沒有警示結構，可以確定該化合物沒有致突變性，可以歸類為遺傳毒性雜質分類列表中的第5類雜質。如果長期給藥的雜質日攝入量大于1mg，不管分類如何，都應進行最低篩選要求的遺傳毒性試驗（點突變和染色體畸變）。任何陽性或相互矛盾的結果可以通過專業知識（與具有細菌回復突變試驗數據且結構相似的類似物比較、由專家對化學結構進行評價以確定化合物是否具有DNA反應性、采用相同方法的其他經驗證的QSAR模型論證等）或開展遺傳毒性試驗進行充分合理論證。當軟件評估的結果與藥監機構或ICH等權威國際組織發布的數據或Ames試驗結果沖突時，以藥監機構和權威國際組織公布的結果或Ames試驗結果為準。
3）遺傳毒性試驗評估
遺傳毒性試驗方法有多種，根據試驗檢測的遺傳終點，可將檢測方法分為3大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據試驗系統，可分為體內試驗和體外試驗。體外試驗通常有細菌回復突變試驗（即Ames試驗，推薦使用，至少應包含5種菌株組合：TA98、TA100、TA1535、TA1537或TA97或TA97a、TA102或大腸埃希桿菌WP2 uvrA或大腸埃希桿菌WP2 uvrA（pKM101），沒有特殊說明時，一般為鼠傷寒沙門氏菌）、體外中期相染色體畸變試驗、體外微核試驗、小鼠淋巴瘤L5178Y細胞Tk基因突變試驗（MLA）等；體內試驗通常有轉基因突變試驗、Pig-a試驗（外周血）、微核試驗（外周血和骨髓）、大鼠肝臟非程序性DNA合成(UDS)試驗、堿性彗星試驗等。上述各試驗的標準方法詳見ICH S2 《人用藥物遺傳毒性試驗和結果分析指導原則》[6]。
QSAR結果不明確或者為3類時，可以進一步開展細菌回復突變試驗或其他體外遺傳毒性試驗；體外結果為陽性時，可以進一步開展體內遺傳毒性試驗，明確體內致突變風險，指導限度制定。其他體內外遺傳毒性試驗的選擇應根據雜質的反應機理和預期靶組織暴露的知識進行科學論證，且試驗設計應參考ICH S2 《人用藥物遺傳毒性試驗和結果分析指導原則》[6]。
第三步，當完成上述文獻檢索或軟件評估過程后，需要根據檢索/評估的結果，即是否具有明確的致突變和致癌性數據，對各化合物進行分類，具體分類標準和M7推薦的控制策略見表2[2]。
表2 ICH M7 化合物致癌性和致突變性分類
| 分類 | 定義 | 擬定的控制措施 |
| 1 | 已知致突變致癌物 | 控制不超過該化合物特定的可接受限度 |
| 2 | 致癌性未知的已知致突變物（細菌致突變陽性，但無嚙齒動物致癌性數據） | 控制不超過可接受限度（合適的TTC） |
| 3 | 有與原料藥結構無關的警示結構，無致突變數據 | 控制步超過可接受限度（合適的TTC）或進行細菌只突變試驗；無致突變性，歸為5類；有致突變性，歸為2類 |
| 4 | 有警示結構，且與經測試無致突變性的原料藥及其相關化合物（例如，工藝中間體）具有相同的警示結構 | 按非致突變雜質控制 |
| 5 | 無警示結構，或雖有警示結構但有充分的數據證明無致突變性或無致癌性 | 按非致突變雜質控制 |
上述不同類別遺傳毒性雜質可接受攝入量計算方式不同，一般可用法規公布的數據、以線性機制為基礎的AI計算方法、以閾值機制為基礎的PDE（Permitted Daily Exposure，每日允許暴露量）計算方法、TTC和分期TTC（屬于AI計算方法的一種）、其他安全性數據等計算獲得。
1）法規公布的限度
ICH M7公布了部分化合物的可接受攝入量[2]，詳見表3。FDA公布了亞硝胺類化合物的可接受攝入量[7]，詳見表4。
表3 ICH M7中的部分化合物可接受攝入量（2-1）
表3 ICH M7中的部分化合物可接受攝入量（2-2）
表4 FDA公布的亞硝胺類化合物可接受攝入量
注：當只含有1個N-亞硝胺類雜質時采用上述AI值計算限度，
含有2個及以上時總AI值應為26.5ng/天。
2）AI計算方法
如果雜質具有足夠的致癌性數據，且非閾值機制，可以采用嚙齒類動物的TD50值通過線性外推計算化合物的AI值。TD50可從CPDB數據庫或第二步文獻檢索中直接獲得，也可使用與CPDB相同方法從已發表的研究中自行計算獲得，ICH M7文末舉例了具體的計算方式[8-9]。TD50的1/50,000相當于終生潛在發生腫瘤的風險為十萬分之一。
3）PDE計算方法
PDE的計算在殘留溶劑和元素雜質中就有廣泛運用，當雜質致突變致癌作用機制為閾值機制時，可通過NO(A)EL、LOEL和不確定因子來計算PDE值。
式中，F1為從不同物種外推到人的因子；
F2為個體差異因子；
F3為根據毒性暴露周期采用的可變因子；
F4為根據毒性嚴重情況采用的可變因子；
F5采用NO(A)EL時，一般為1，采用LOEL時，根據毒性嚴重程度確定，最高為10。
PDE的具體計算在ICH Q3C和Q3D中有詳細舉例，式中參與計算的NO(A)EL和LOEL值單位為mg/kg/天，采用第二步文獻檢索時，有時候獲得的NO(A)EL和LOEL值為吸入研究的結果，單位是ppm，需要結合種屬體重和呼吸量轉換為mg/kg/天。F1~F5的具體數值需要結合獲得NO(A)EL和LOEL值的長期（慢性）動物試驗過程來確定。此處注意大鼠（rat）和小鼠（mouse和mice）的區別。進行第二步文獻檢索時，可在IRIS、HSDB、ITER等檢索到NO(A)EL和LOEL值。
有時候NO(A)EL和LOEL值較難獲得時，也有采用LD50（50%動物致死量）計算NOEL值的情況存在，具體公式如下：
這個公式來自于APIC《Guidance on Aspects of Cleaning Validation in Active Pharmaceutical Ingredient Plants》[10]，式中NOEL單位為mg/天，70kg為歐洲人體重，2000為口服劑型的原料藥安全系數，獲得的NOEL值進一步用于MACO（Maximum Allowance Carryover，允許最大殘留）計算，而不是PDE計算。LD50為急性毒性試驗結果，NOEL為長期（慢性）毒性試驗結果，D.W.Layton等研究過從LD50→NOEL的可行性[11]，但是LD50→NOEL→PDE的過程在殘留溶劑、元素雜質、遺傳毒性雜質等的可接受攝入量的計算中本身存疑較多，不建議使用。
目前一般認為，致突變雜質直接引起DNA損傷，以線性機制為主，因此可接受攝入量計算更多還是以AI、TTC等為主，對閾值機制的研究較少，PDE計算方式的使用需要更多毒理學評估，明確閾值機制存在。
4）其他安全性數據計算可接受攝入量
除了TD50、NO(A)EL、LOEL等毒理學數據，在第二步文獻檢索時也能獲得化合物相應于十萬分之一風險水平的飲用水限度（IRIS）、吸入劑量（IRIS）、MRL（ATSDR）、NSRL（CalEPA）、BMDL10等可直接或進一步計算獲得最終的可接受攝入量。注意，應以最新且具有科學支持的數據作為計算基礎。
上述各數據推導可接受攝入量過程舉例如下：
①當IRIS公布的某化合物相當于1/100,000風險水平的飲用水限度為0.1μg/L時，日飲用水量為2L/天（設定值），可接受攝入量為0.1μg/L×2L/天=0.2μg/天；
②當IRIS公布的某化合物相當于1/100,000風險水平的吸入暴露量為0.8μg/m3時，日呼吸量為20m3/天（設定值，有時候采用28,800L/天），可接受攝入量為
0.8μg/m3×20m3/天=16μg/天；
③采用MRL計算PDE：
PDE=MRL（mg/kg/天）×50kg，
或PDE=MRL(mg/m3)/1,000m3/L×28,800L/天
校正因子已經包含在MRL值中，PDE計算不需要安全系數。
用于元素雜質的可接受攝入量計算需要區分不同給藥途徑的MRL值，但是遺傳毒性雜質除非存在特定給藥方式問題（如腫瘤的部位特異性或化合物的強效接觸位點致癌性），否則無需根據給藥途徑調整可接受攝入量，一般首選長期/慢性毒性試驗得到的最低的MRL值。
④NSRL（如40μg/天）可以直接作為可接受攝入量；
⑤查閱的BMDL10可以直接除以10,000線性外推至十萬分之一風險發生率。
5）TTC或分期TTC
對于無毒理學研究數據的雜質可以采用TTC（單個雜質，1.5μg/天）作為可接受攝入量。TTC是從最敏感物種和腫瘤發生最敏感部位獲得的TD50（1.25mg/kg/天）線性外推至十萬分之一風險發生率的劑量，通用于大部分藥物。如果有2個2類或3類雜質，應制定每個雜質的可接受攝入量；如果質量標準中有3個及以上的2類或3類雜質，應按表5控制總可接受攝入量。其中1類雜質和制劑中形成的降解產物應單獨控制，不計入總可接受攝入量。
短于終生給藥的藥品中致突變雜質的TTC值可調整為更高劑量，即1.5μg/天累積70年的總量（38.3mg）平均分配到短期的總給藥天數中，具體調整見表5。間歇給藥時應根據總給藥天數計算。
表5 單個雜質和總雜質的TTC和分期TTC
| 治療期 | ≤1個月 | >1~12個月 | >1~10年 | >10年~終生 |
| 單個雜質TTC(μg/天) | 120 | 20 | 10 | 1.5 |
| 多個雜質總TTC(μg/天) | 120 | 60 | 30 | 5 |
從TD50值推導的AI值，也可以根據給藥周期，按照表5的比例同等放大短期給藥的可接受攝入量，但不超過0.5%。舉例，如果終生暴露時，某化合物可接受攝入量為15μg/天，短于終生暴露時限度可增加至100μg/天（＞1~10年治療時長），200μg/天（＞1~12個月治療時長）或1200μg/天（<1個月治療時長）。但是，如果最大日服用劑量為100mg，則<1個月時長的每日可接受攝入量應為0.5%×100mg=500μg，而不是1200μg。此方法不適用于閾值機制的PDE放寬數值，但是對于短期暴露（≤30天），具體問題具體分析后，可以提高雜質可接受攝入量。
6）其他情況
對于與已知的某類致癌化合物在化學結構上相似的雜質，充分論證相似理由（結構相似，致癌致突變機理相似）后，可以按相似化合物的可接受攝入量計算。
如果某雜質通過其他途徑（食品、內源性代謝物等）在人體中的暴露量更大，可接受攝入量可以提高；致突變代謝產物的限度制定通常需要結合體內遺傳毒性研究結果制定，致突變制劑降解產物限度制定通常取決于長期穩定性試驗結果。
參考藥典收載的其他品種某遺傳毒性雜質化合物的限度時需要注意，不可直接使用，應考慮該品種的給藥周期和日服用劑量是否與待計算品種一致。
從上述各途徑獲得的雜質可接受攝入量（AI、PDE、TTC等）計算限度如下：
式中，藥品最大日服用劑量來自藥品說明書。
第四步，按上述步驟篩選出來的遺傳毒性雜質或潛在遺傳毒性雜質，應分析其在API、中間體或制劑產品中殘留的可能性。遺傳毒性雜質的親電性使得它們一般具有一定化學反應活性，詳見表6[3]。在API合成工藝中，這些雜質可能在后續反應步驟中去除，也可能反應生成其他物質，最后殘留在產品中的可能性較低。不過藥監機構不太認可純理論分析，在雜質控制策略中可以結合清除因子和檢測結果證明產品或中間產品中的雜質殘留情況。
表6 遺傳毒性雜質按化學反應活性分類
| 化學反應活性 | 遺傳毒性雜質結構類別 |
| 高活性 | 環氧化物、醛類、磺酸酯類、肼類、酰基鹵化物、氮雜環丙烷 |
| 中等活性 | 硫芥類、氮芥類、邁克爾反應受體、鹵代烯烴、 |
| 低活性 | 嘌呤、嘧啶、氨基甲酸酯類、芳香胺、硝基化合物 |
注：高活性指極易與親核試劑反應。
為了量化分析雜質殘留可能性，將雜質的物理化學性質和工藝過程結合起來，提出了清除因子（表7）的概念，數值越大，代表工藝清除的可能性越高。特定雜質在特定工藝流程中的總清除因子為各步清除因子的乘積。當清除因子大于10000時，雜質在API中的殘留可能性極低，除非每日最大劑量在1g以上，否則可以不做相關控制；當清除因子在100~10000之間時，需要做加標實驗證明工藝路線的清除能力；當清除因子在100以下時，說明雜質在最后或者倒數第二步引入，需要謹慎對待，并嚴格控制。[3,12]
表7 物理化學性質與清除因子
| 物理化學性質 | 清除因子 |
| 化學反應活性 | 高活性=100中等活性=10低活性=1 |
| 溶解性 | 易溶=10溶解=3略溶或不溶=1 |
| 揮發性 | 雜質沸點比溶劑沸點低20℃以上=10雜質沸點在溶劑沸點的±10℃范圍內=3雜質沸點在溶劑沸點的20℃以上或者不揮發=1 |
| 電離度 | 雜質的潛在電離度與API或基質明顯不同=10 |
| 柱層析 | 雜質先于API洗脫=100雜質后于API洗脫=10 |
| 重結晶 | 雜質在重結晶溶劑中易溶=100雜質在重結晶溶劑中略溶=1 |
| 其他工藝流程，如樹脂處理 | 具體情況具體分析 |
第五步，可能存在于API/制劑中的遺傳毒性雜質，需要開展遺傳毒性試驗確認，通常是Ames試驗，或者直接在各步控制在特定限度以下。
Ames試驗結果為陰性時，按照普通雜質控制；Ames結果為陽性，但是雜質在產品或中間產品中能控制在特定限度以下，也可以接受；Ames結果為陽性，雜質在限度以上，可以進行體內遺傳毒性試驗，體內結果為陰性，按一般雜質控制；也可以重新評估工藝和路線，將雜質控制在限度以下；如果工藝控制不能將雜質水平降低至可接受限度以內，而雜質是ALARP水平，可以根據風險/收益分析合理提高雜質限度。
基于對產品和工藝的理解，以及風險管理原則，可將雜質控制點向上游移動，盡量減少終產品檢測。ICH M7推薦4種API工藝雜質控制方法[2]：
方法1：定入API質量標準（常規檢測或定期檢測）；
方法2：工藝上游控制-定入起始物料或中間體的內控標準；
方法3：工藝上游控制-定入起始物料或中間體的內控標準或過程控制，限度適當放寬，但是需要明確雜質去向和清除信息，并確認API中雜質始終控制在30%可接受限度內；
方法4：無需制定標準-明確工藝參數及其對殘留雜質水平的影響，確信API中雜質存在風險可忽略不計（如1%TTC[5]）。方法4適用于自身不穩定或工藝早期引入的可被有效清除的雜質，其可接受性由藥監機構根據具體問題具體分析。
對于制劑降解雜質的控制，ICH M7建議根據降解試驗（加速試驗、光穩定性試驗、強制降解試驗、原輔料相容性試驗等）評估降解途徑與原料藥和制劑的生產工藝和儲藏條件的相關性，采取相應措施盡量控制致突變降解雜質產生和增長，雜質限度制定取決于長期穩定性試驗結果。
各企業對遺傳毒性雜質的研究和控制，可分類進行。同一類別雜質的致突變致癌作用機制、產生和清除機理、可接受攝入量制定、分析檢測方法等有一定相似性，在項目運行過程中收集各品種的各類遺傳毒性雜質信息，逐步建立企業自己的遺傳毒性雜質庫，在后續同類別遺傳毒性雜質研究和控制中可以節約時間成本。
四、結語
在遺傳毒性雜質的實際風險評估過程中，目前還大量存在根據文獻[13]公布的警示結構“目測”化合物（大部分時候所列出的雜質譜清單不齊全）是否具備潛在的遺傳毒性，沒有進行可靠文獻檢索和QSAR評估，根據“目測”的結果，結合用藥周期和最大日服用劑量，采用TTC或分期TTC計算出雜質限度，開發相關方法，檢測多批次樣品，根據結果作出相應的工藝調整，如果調整不了，尋求放寬限度的方法以使產品合格，完成遺傳毒性雜質評估。這種評估方式在歐美申報中是不被認可的，在國內申報中也將逐步退出歷史舞臺。
參考文獻
1. 中國藥典2020版四部通則9306 遺傳毒性雜質控制指導原則.
2. ICH Harmonised Guideline: Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk(R1).2017.
3. Andrew Teasdale, et al. Genotoxic impurities strategies for identification and control. John Wiley & Sons, Inc.,2010.
4. Romualdo Benigni, et al.Mechanisms of chemical carcinogenicity and mutagenicity：A review with implications for predictive toxicology. Chemical Reviews 2011;111:2507-2536.
5. ICH Harmonised Guideline: Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk(R1), Questions and Answers. 2020.Version 29.
6. ICH Harmonised Guideline: Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use(R1).2011.
7. FDA Guidance for industry: Control of nitrosamine impurities in human drugs.2020.
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10. Active Pharmaceutical Ingredients Committee (APIC). Guidance on aspects of cleaning validation in active pharmaceutical ingredient plants. 2016.
11. D.W.Layton, et al. Deriving allowable daily intakes for systemic toxicants lacking chronic toxicity data. Regulatory toxicology and pharmacology 1987; 7:96-112.
12. Nevenka Kragelj Lapanja, et al. Theoretical purge factor determination as a control strategy for potential mutagenic impurities in the synthesis of drug substances. Acta Chimica Slovenica 2017; 64:1-14.
13. Romualdo Benigni, et al. Development of structural alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents. JRC Scientific and Technical Reports 2009.
來源：上海博志研新
