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本文主要介紹了山東奧新醫療科技有限公司研發的醫療器械“SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）”的臨床前研發實驗。

一、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的產品主要組成成分

二、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的產品預期用途

本 試 劑 盒 用 于 體 外 檢 測 人 外 周 血 血 漿 中 SHOX2 、RASSF1A、PTGER4 基因的甲基化。 

本產品用于臨床上對疑似肺癌患者的輔助診斷，檢測結果陽性不作為肺癌早期診斷或確診的證據，檢測結果陰性也不能 

排除肺癌的可能。該檢測不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據，不宜用于普通人群的腫瘤篩查。SHOX2 屬于 SHOX 基因家族，在胚胎形成期對骨骼、心臟和神經系統的發育作用重大，在肺癌、乳腺癌和腎癌中異常表達。RASSF1A 調控涉及基因轉錄、信號轉導、細胞周期、細胞凋亡等多種生物學功能，可以通過多種途徑抑制腫瘤形成。PTGER4 屬于 G 蛋白偶聯受體家族，是非常重要的抑癌基因。研究發現，肺癌患者血漿樣本中 SHOX2、RASSF1A 及 PTGER4三基因啟動子區域呈高度甲基化。

三、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的包裝規格

30 人份/盒。 

四、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的產品檢驗原理

提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉化未發生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應產生尿嘧啶磺酸鹽，發生甲基化的胞嘧啶則不會被亞硫酸鹽轉化。將亞硫酸鹽轉化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴增，PCR 反應中的引物、探針能區分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優先得到擴增，與甲基化 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 基因序列特異性結合的熒光素探針可以在 PCR 反應中專一地檢測出甲基化序列。內參對照ACTB（β-actin）基因用于評估檢測中 DNA 量是否足夠。

五、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的主要原材料的選擇

本產品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應液、人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA。這些原料均是通過外購的方 式獲得。 

其中引物的序列均由艾克倫醫療自行設計，由合成公司經過合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應液由供應商化學合成獲得；人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA由供應商提取純化獲得。 

艾克倫醫療對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。 

六、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的企業參考品設置情況 

本產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品，組成如下：陽性參考品包括 12種。P1、P2、P3為一定 DNA 濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均為甲基化的不同甲基化比例的參考品；SP1、SP2、SP3為一定 DNA 濃度不同比例的SHOX2單甲基化參考品；RP1、RP2、RP3為一定 DNA 濃度不同比例的RASSF1A單甲基化參考品；PP1、PP2和PP3為一定DNA 濃度不同比例的PTGER4單甲基化參考品。陰性參考品包括 4種，包括三種不同DNA濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4均無甲基化的參考品，一種三基因均甲基化但甲基化比例低于檢測限的陰性參考品。精密度參考品包括6種。J1、J2為一定DNA 濃度，SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。SJ1、SJ2為一定DNA 濃度，SHOX2單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。RJ1、RJ2為一定DNA 濃度，RASSF1A單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。PJ1、PJ2 為一定DNA 濃度，PTGER4基因單甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。 

檢測限參考品包括 4 種。包括低 DNA 濃度的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4三基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的 SHOX2單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的RASSF1A單基因 甲基化參考品，低 DNA 濃度的 PTGER4單基因甲基化參考品。 

七、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的生產工藝及反應體系研究 

艾克倫醫療對試劑盒反應體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR 反應液的選擇、陰/陽性質控品配方的確定等；對PCR過程中的退火溫度進行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時間 的 研 究 ； 對 該 產 品 三 種 適 用 機 型 宏 石 PCR 分 析 系 統SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應程序及分析條件進行了研究。通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。艾克倫醫療根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。 

八、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的分析性能評估研究

本產品分析性能評估內容包括：準確性（陽性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測限、分析特異性的評估；核酸提取試劑的性能評估；三種適用的 PCR 儀機型（宏石 PCR 分析系統SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評估。 

準確性研究使用企業陰/陽性參考品及臨床樣本來源的陰性 /陽性/弱陽性樣本池分別對三個批次的試劑盒進行檢測，檢測結果顯示陽性符合率 100%、陰性符合率 100%。同時用試劑盒與 同類對比試劑分別檢測臨床樣本，包括各期肺癌樣本共 128 例及肺結核樣本 32 例，結果顯示試劑盒對于Ⅰ~Ⅳ期肺癌和肺結核樣本監測的準確率分別為 78.13%、87.50%、84.38%、87.50%和81.25%。 

精密度的研究使用了兩種不同的樣本，第一種樣本是精密度參考品，對三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進行檢測。 檢測結果顯示試劑盒檢測的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和ACTB 基因的變異系數均小于 10%。第二種樣本是通過在臨床正常人血漿樣本中添加一定濃度的細胞系 DNA 模擬精密度企業參考品進行驗證，檢測結果顯示 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因的變異系數均小于 10%。同時也對配套用核酸提取試劑的精密度進行了研究，結果表明在樣本采集過程、核酸提取過程中 DNA 提取量變異系數小于 10%；核酸轉化過程中，ACTB 基因 Ct 值的變異系數均小于 10%。檢測限研究，以陰性血漿樣本為基質，對不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進行檢測，得到血漿樣本的檢測限，并在三種適用機型上進行驗證。結果表明試劑盒可檢測血漿中陽性 DNA 最低濃度為 0.1pg/µL。在血漿 DNA濃度為 0.02ng/µL 時，產品檢測 P 值為陽性的檢測限為 0.5%三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2 甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。使用三批試劑盒對四種檢測限參考品進行檢測驗證，結果表明對于DNA濃度為0.02ng/µL的參考品，P值為陽性的檢測限為0.5%的三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。 

特異性研究，交叉反應實驗結果表明試劑盒檢測干擾樣本的綜合特異性超過 85%。對于發生肺轉移的其它原發癌癥（包括肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結直腸癌）檢出率較低，假陽性率低于 25%，說明產品僅適用于原發性肺癌的檢測。檢測自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風濕性關節炎的特異性超過 90%，假陽性率低于 10%。檢測其它肺部疾病的特異性超過 85%，假陽性率低于 15%。檢測宮頸癌特異性為 80%，假陽性率為 20%。 干擾實驗顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA （150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對檢測結果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮痛藥等在最大使用劑量范圍內，不影響試劑盒對樣本檢測的 Ct 值及 P 值判定。 

對與試劑盒聯合使用并在說明書中推薦的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號，北京艾克倫醫療科技有限公司）進行了性能評估，結果表明產品配套使用的核酸提取試劑，提取效率、保護效率和轉化效率分別為 85.18%、93.52%和 99.32%。 

對該產品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統 SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進行了性能評估，結果顯示在三種適用機型上的陰/陽性符合率、檢測限、精密度均符合質量要求，可以作為該產品的檢測 PCR 儀。 

九、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的陽性判斷值研究 

艾克倫醫療采用三基因擬合 P 值公式法確定陽性判斷值。每個樣本進行 3 次 PCR 平行測試，計算 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和 ACTB 基因 3 個復孔平均 Ct 值，其中各個基因無擴增時，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時，樣本檢測結果有效。在確定樣本檢測結果有效的情況下，樣本 P 值≥2.0 則判斷樣本為陽性，樣本 P 值＜2.0 則判斷樣本為陰性。 

陽性判斷值研究入組（訓練集和驗證集）有效樣本數共計489 例，包括肺部正常樣本 207 例、肺癌病人樣本 141 例、其它干擾樣本（包括結節、肺炎、肺結核、囊腫、食管癌、胃癌等）141 例。樣本數據進行多種方法統計分析，包括 1/3 次 PCR 反應 Ct 值、2/3 次 PCR 反應 Ct 值、3/3 次 PCR 反應 Ct 值、3 次PCR 反應平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測準確率最高。并使用測試集樣本再次驗證三基因擬合公式和其他陽性判斷值方 法，測試集研究入組有效例數 248 例，包括肺部正常人樣本 81例，肺癌病人樣本 76 例，其他干擾樣本 91 例。結果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.19%（95%CI：90.65%-97.72%），靈敏度為 89.47%（95%CI：82.41%-96.53%），總符合率為 92.74% （95%CI：89.49%-95.99%）。 

十、SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的穩定性研究 

艾克倫醫療對該產品的穩定性的研究包括長期穩定性、使用穩定性（包括開瓶穩定性、凍融穩定性和熱穩定性）及樣本穩定性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩定性）。 

長期穩定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲存后的第 0、3、6、9、12、13、14、15 個月進行檢測，結果顯示產品在生產后 15 個月的產品性能符合技術要求，試劑性能穩定。確定產品有效期可達 12 個月。 

使用穩定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開瓶放置 6 周后，穩定性結果 P 值及 CV 值均無顯著差異，無顯著變化趨勢，其產品的主要性能均符合技術要求。將三批次試劑盒在規定的儲存條件下，取出試劑盒反復凍融 6 次，檢測每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1天、2 天、3 天后檢測產品性能，均符合技術要求。 

艾克倫醫療對全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩定性進行了研究，研究結果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer®， 6mL，國械注進 20152222083）采集全血，建議選用 2-8℃放置 4 小時以內的新鮮血樣分離血漿后用于檢測；使用康為游離 DNA 采血管（康為世紀，5mL，蘇械注準 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內的血樣分離血漿后用于檢測。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內，在 2-8℃保存12 小時以內進行檢測；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內，在 2~8℃保存 16 小時以內進行 PCR 檢測。