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嘉峪檢測網 2022-08-11 08:47
本文主要介紹了杭州可幫基因科技有限公司研發的醫療器械“腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）”的臨床前研發實驗。
一、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的產品主要組成成分
試劑盒由以下組分組成，主要組成成分見表 1。
表 1 試劑盒主要組成成分
二、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的產品預期用途
本產品適用于定性檢測組織分化程度較差或疑似轉移的實體腫瘤患者的福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本中 90 個組織特異基因表達模式（Gene Expression Pattern），用于判別腫瘤組織起源，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌和尿路上皮癌。
本產品與《腫瘤組織起源基因分析軟件》配合使用，不用于區分原發性腫瘤與轉移性腫瘤。在惡性腫瘤病理檢查過程中，對于不能排除為轉移性腫瘤的患者，本產品可為病理醫生診斷腫瘤的類型和組織起源提供支持；但在確定腫瘤分期、評估預后和指導治療等方面，本產品不能替代免疫組化。同時，本產品的檢測結果不能作為癌癥診斷的唯一依據。病理醫生還應參考病史信息、影像學檢查和其他病理檢查結果，對受檢標本的腫瘤類型和組織起源進行綜合判斷，出具診斷報告。本產品不適用于淋巴瘤和經脫鈣處理的骨腫瘤樣本。
病理診斷是當前腫瘤診斷的金標準，而免疫組化檢測則是病理診斷中對腫瘤進行分型的基礎，對于腫瘤分化程度較差（HE切片上缺少腫瘤細胞起源的特征）或者疑似轉移性腫瘤尤為重要。腫瘤的分型通常需要聯合數個免疫組化抗體，分步驟地進行檢測，病理醫生往往只能選取數量有限的免疫組化抗體進行檢測。免疫組化用于腫瘤診斷所面臨的挑戰還包括，對于部分腫瘤無法找到特異性的免疫組化抗體。當缺乏特異性的免疫組化標記或少數非特異性免疫組化標記為陽性時，病理診斷往往只能給出較為模糊的診斷結果。國內外文獻報道，轉移性腫瘤的基因表達譜與轉移部位組織的基因表達譜存在差異，而與其原發部位組織的基因表達譜更相似，提示腫瘤在其發生、發展、轉移的過程中，始終保留其組織起源的分子特征。因此，基因表達譜檢測可在分子水平揭示腫瘤的組織起源，進而實現對腫瘤的分型。
三、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的產品包裝規格
10 測試/盒
四、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的產品檢驗原理
該產品基于實時熒光 PCR 平臺，檢測腫瘤樣本 RNA 中組織特異基因的表達模式，并與參考數據庫中已知腫瘤類型的基因表達模式進行比對，判斷待測腫瘤樣本組織起源。該產品利用特異引物對 90 個組織特異基因進行 PCR 擴增，并通過 TaqMan-MGB 探針對擴增產物進行檢測，在實時熒光PCR平臺上獲取樣本組織特異基因的表達模式。采用《腫瘤組織起源基因分析軟件》對待測樣本的基因表達模式進行分析，軟件可自動比較待測樣本與已知組織起源的腫瘤基因表達模式之間的相關性，從而判斷待測腫瘤樣本的組織起源。《腫瘤組織起源基因分析軟件》參考數據庫涵蓋根據組織細胞起源和解剖學部位定義的 14 種腫瘤類型，具體包括：乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、胃及食管癌、腎癌、肝膽腫瘤、肺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌及尿路上皮癌。該產品選用人源管家基因作為內部參照（以下簡稱內參）系統，對樣本 RNA 提取、逆轉錄和 PCR 反應過程進行質量控制。
五、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的主要原材料
1.主要原材料的選擇
該產品的主要原材料包括引物、探針、dNTPs、DNA 聚合酶、隨機引物、逆轉錄酶及對照品等。原材料均通過外購的方式獲得?？蓭突驅χ饕牧线M行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。
2.企業參考品和質控品設置情況
該產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和重復性參考品。質控品分為陽性對照品和陰性對照品。企業參考品的主要原材料為臨床組織樣本。陽性參考品包括28 種，分別為該產品涵蓋的 14 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本。陰性參考品包括 8 種，分別為該產品不涵蓋的 5 種腫瘤類型的 FFPE 腫瘤組織樣本，以及 3 種 FFPE 正常組織樣本。檢測限參考品包括 15 種，分別為 14 種腫瘤類型最低檢測限參考品，由陽性參考品的 RNA 稀釋而成；以及 1 種基因表達最低檢測限參考品，涵蓋該產品所有檢測基因。重復性參考品包括 2 種，分別為涵蓋該產品所有檢測基因的強陽性重復性參考品和弱陽性重復性參考品?；虮磉_最低檢測限參考品和重復性參考品均由臨床腫瘤組織 RNA 樣品經逆轉錄得到 cDNA，采用數字 PCR 方法測定拷貝數后進行稀釋而成。
該試劑盒同時設置了陽性對照和陰性對照，用于檢測過程中試劑和儀器的質量控制。此外，每個樣本均檢測內參基因，用于結果的判讀及評估樣本的質量。
六、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的生產工藝及反應體系研究
可幫基因對試劑盒反應體系的研究包括引物探針濃度的確定、PCR 擴增預混試劑用量的確定、dNTPs 濃度的確定、隨機引物濃度的確定、逆轉錄酶濃度的確定等；對 PCR 反應條件的研究包括 PCR 反應程序的優化、基線閾值和閾值循環數的確定；對樣本采集要求、樣本保存時間、樣本核酸提取方法和樣本用量進行了研究。對產品檢測范圍內的全部癌種分別進行樣本 RNA 的提取及濃度、純度的研究，確定提取后 RNA 濃度應≥60ng/μL 且其A260/A280 應在 1.7～2.1。通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系?？蓭突蚋鶕噭┖兄性噭┘敖M件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。
七、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的分析性能評估
該產品分析性能評估內容包括樣本穩定性、準確度、分析特異性、最低檢測限、精密度、包容性、干擾物質研究。
1.樣本穩定性研究
可幫基因對該產品適用的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）病理組織切片保存穩定性、對提取后的 RNA 樣本保存條件和凍融穩定性進行了研究。確定該產品可以檢測保存時間不超過 3 年 的 FFPE 樣本；提取后的 RNA 樣本在-70℃~-80℃保存不超過 6個月，凍融次數不超過 3 次。
2.準確度研究
可幫基因檢測 28 份企業陽性參考品，檢測結果分別為對應的腫瘤類型，陽性符合率 100%；檢測 8 份企業陰性參考品，檢測結果均為陰性，陰性符合率 100%；檢測 90 份病理診斷結果明確的低分化或未分化腫瘤和轉移性腫瘤臨床樣本，準確性為 100%。
3.分析特異性
分析特異性研究包括組織起源鑒別能力研究和交叉反應研究?？蓭突蜻x擇產品檢測范圍內的全部癌種的轉移性腫瘤樣本，使用三個批次的試劑盒對該產品的組織起源鑒別能力進行研究，檢測結果顯示能準確鑒別腫瘤組織及其配對癌旁組織樣本的不同組織起源?？蓭突蜻x擇產品檢測范圍外的 8 種腫瘤組織或正常組織樣本進行交叉反應研究，包括淋巴瘤、陰莖癌、骨髓瘤、胸腺癌、皮膚鱗癌、淋巴結組織、扁桃體組織、皮膚組織，結果均為陰性。
4.最低檢測限研究
最低檢測限研究包括各個靶基因最低檢測限的研究和可檢測腫瘤組織最低比例的研究。
可幫基因使用三個不同批次的試劑盒分別對產品 90 個靶基因的最低檢測限進行研究，確定試劑盒對于每個靶基因最低檢測限，結果顯示各個靶基因的最低檢測限為 5 拷貝/μL 至 50 拷貝/μL。
可幫基因使用三個不同批次的試劑盒分別對產品檢測范圍內的全部癌種進行研究。對每種腫瘤類型的不同腫瘤細胞比例的樣本進行檢測，確定可檢測腫瘤組織的最低比例為腫瘤細胞比例 60%。
5.精密度
精密度研究采用三個不同批次的試劑盒，通過不同地點、人員、輪次、日間和批次對不同癌種的腫瘤臨床樣本進行連續 20天精密度研究，檢測結果（相似度分數最大值）變異系數 CV 均不高于 15%。
對連續三批生產的試劑盒采用企業強陽性重復性參考品和弱陽性重復性參考品進行重復性檢測，每批試劑盒每份參考品重復檢測 10 次，每個靶基因的 Ct 值變異系數 CV 均不高于 5%。
6.包容性研究
可幫基因采用三個不同批次的試劑盒對試劑盒檢測范圍內的各腫瘤類型及相關亞型進行包容性確認，結果表明試劑盒對各腫瘤類型及其相關亞型均能正確檢出，試劑盒包容性良好。
7.干擾物質研究
干擾物質研究分為外源性干擾物質研究和內源性干擾物質研究。
外源性干擾物研究包括針對 FFPE 樣本在處理過程中的常見的酒精、福爾馬林和石蠟的干擾試驗研究。研究結果表明，當酒精≤1%（V/V）、福爾馬林≤0.005%（V/V）、石蠟≤1%（V/V）
時，對該產品的檢測結果不產生干擾。
內源性干擾物研究包括針對癌旁組織和壞死組織的干擾試驗研究。研究結果表明，當待測樣本中癌旁組織或壞死組織比例≤40%時，對該產品的檢測結果不產生影響。
八、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的陽性判斷值研究
該產品陽性判斷值的研究采用診斷信息明確的 600 例臨床腫瘤樣本，涵蓋全部腫瘤類型。對 600 例腫瘤臨床樣本的最大相似度分數采用最優離散化算法確定試劑盒的相似度分數陽性判斷值為 45.3。結果顯示當相似度分數＜45.3 時，樣本的檢測結果為陰性；當相似度分數≥45.3 時，樣本的檢測結果為陽性。當以最大相似度分數45.3作為陽性判斷值，對診斷明確的臨床腫瘤樣本的組織起源或類型進行判定時，各腫瘤類型的陽性符合率和陰性符合率，結果如下：
九、腫瘤組織起源基因檢測試劑盒 （PCR熒光探針法）的穩定性研究
可幫基因對該產品的穩定性研究包括貨架效期穩定性、運輸穩定性和使用穩定性（包括開瓶穩定性、凍融穩定性）。貨架有效期穩定性：將三批次試劑盒置于-15℃~-25℃保存，分別于不同時間點使用企業參考品對試劑盒的性能進行檢測，結果表明試劑盒在-15℃~-25℃保存條件下，產品有效期為 12 個月。此外，可幫基因對產品的運輸穩定性和使用穩定性分別進行了研究。結果顯示產品的性能均滿足產品說明書的聲稱。
來源：嘉峪檢測網
