近期，上海市第九人民醫院眼科阮靜副研究員和新加坡A*STAR材料和工程研究所（IMRE）Xian Jun Loh教授合作在期刊 Bioactive Materials 上發表研究論文。該研究設計了一種可用于骨修復及監測的活性傳感支架，該支架材料具有遠期骨誘導活性和近期電化學傳感特性，為骨組織再生、早期監測和療效評價提供了新的科研思路。
1、研究內容簡介
嚴重創傷、手術切除和先天性畸形導致的骨缺損修復在臨床上仍然具有挑戰性。近年來，已經開發出多種作為骨再生的支架替代物的新材料。然而，新骨再生率和支架降解率之間的不匹配仍是骨缺損修復中一大難題。此外，在復雜的生理環境下，來自不同供體的種子細胞的增殖能力和成骨潛能存在顯著差異。因此，監測骨再生過程中的組織礦化程度對于評估骨修復效果至關重要。
近來，電化學傳感器在細胞與界面之間相互作用的連續監測應用中受到廣泛關注。碳納米管（Carbon nanotubes，CNT）由于具有高比表面積、良好導電性和π-π共軛作用，已被廣泛用于電化學生物傳感器的制備。同時，CNT還具有良好的成骨誘導活性和傳導活性。然而，考慮到CNT作為生物支架首先應具有良好的生物相容性，研究團隊將CNT進行羧基化改性后與生物大分子殼聚糖（CMC）進行交聯固化，制備了一種具有三維多孔結構的電化學傳感生物活性支架（CNT/CMC支架），該支架在兼具良好生物相容性和骨誘導活性的基礎上，CNT 化學結構表面依然可通過C-C之間的離域π鍵表現出良好的電化學傳感特性 (圖1)，相對于傳統CT監測技術，該傳感支架具有靈敏度高、檢測方法簡單的優勢，可有效用于新骨再生和缺損修復的監測。
圖1 智能活性支架實現骨修復及監測的原理示意圖
該研究開發的支架材料是基于多位點化學交聯反應制備，具有三維多孔連通結構，相較于單純CMC支架，CNT/CMC支架具有更高的孔隙率和力學強度。同時穩定的共價交聯作用和空間位阻效應也賦予了CNT/CMC支架具有降解可控性，在加速降解實驗中，15天降解率約達50%，相對于CMC支架，降解速率得到有效控制（圖2）。
圖2 CNT/CMC支架的微觀形態、力學性能及降解性能
研究通過細胞增殖、細胞活-死染色、蛋白定量及qPCR等方法優化了支架材料中羧化CNT的最佳比例。當CNT含量為0.5%時該支架具有較好的細胞相容性（圖3 a,b）；掃描電鏡顯示干細胞于CNT周圍融合生長、附著于支架孔隙結構中(圖3 c）。同時，通過定量檢測早期成骨相關蛋白ALP以及早期成骨相關基因ALP, BSP, Col1A1, OCN 及OSX，發現CNT含量為0.5%的支架具有最優的骨向誘導活性（圖3 d-i）。
圖3 CNT/CMC支架細胞相容性及成骨誘導活性優化
研究團隊進一步評價了CNT/CMC支架材料體外成骨誘導活性，發現CNT/CMC支架組成骨相關基因（ALP, BSP, Col-1 及Runx2）的mRNA表達水平（圖4 a-d）和成骨相關標志蛋白（Col1A1, Runx2, OPN, BSP, OSX及OCN）的表達水平（圖4 e-f）均顯著升高，并且細胞水平的成骨外基質（ALP、ARS）染色結果也驗證了這一結論（圖4 g-h）。而添加了生長因子BMP2的CNT/CMC/BMP2組短期內也表現出優異的骨誘導活性，一定程度上說明CNT/CMC支架具有良好的生物相容性。同樣中長期內，CNT/CMC支架的骨修復效果在大鼠顱骨標準骨缺損模型中也進行了系統評估，Micro-CT顯示植入CNT/CMC及CNT/CMC/BMP2支架后大鼠顱骨缺損修復程度比空白及CMC支架對照組有明顯提高，骨體積/組織體積、骨小梁數目、骨密度檢測也證實CNT/CMC及CNT/CMC/BMP2支架具有更好的中長期成骨誘導活性（圖5a-d）。CNT/CMC支架在植入大鼠顱骨缺損后不同時間分別進行了四環素、茜素紅、鈣黃綠素熒光染色，并且植入8周后進行行硬組織切片和膠原纖維組織學染色，綜合評估新生骨形成情況，組織水平的定量分析結果提示CNT/CMC具有良好的促成骨性能（圖5 e-i）。
圖4 CNT/CMC支架體外成骨誘導活性
圖5 CNT/CMC體內成骨誘導活性
最后，研究團隊系統評估了CNT/CMC支架對新骨再生過程中成骨分子標志物ALP和礦化程度的電化學響應性能。體外檢測原理利用ALP可將電化學惰性的4-氨基苯基磷酸鹽鈉鹽水合物（pAPP）催化形成具有氧化還原性的對氨基苯酚（pAP）從而產生電化學響應信號，將接種干細胞分別培養2、5、10天的CNT/CMC支架于pAPP溶液中測定循環伏安（CV）曲線，發現隨培養時間延長，電化學響應信號越高，反映成骨標志物ALP生成量逐漸增加 （圖6a-d），CV曲線信號增強。隨著細胞骨向分化程度增加，礦化基質沉積于支架表面，導致CNT/CMC支架電阻增加，導電性能下降，從而引起CV曲線信號減弱。利用這一變化趨勢，研究團隊在體外（圖6 e-j）及大鼠體內（圖7）分別驗證了CV曲線信號用于監測CNT/CMC支架促新骨再生情況，結果表明，CNT/CMC支架在體外可檢測成骨分子標志物ALP低至0.2unit/mL, 在體內可從第一周開始監控新骨礦化程度。
圖6 CNT/CMC支架體外成骨誘導電化學響應
圖7 CNT/CMC支架體內成骨誘導電化學響應
總體而言，該研究團隊設計開發了一種新型CNT/CMC化學傳感活性支架，該支架可聯合生長因子BMP2誘導活性和CNT傳導活性有效促進新骨再生，并且該傳感支架也可以通過電化學檢測方法有效評估細胞骨向分化和新骨礦化程度，為骨組織再生修復過程中的早期、靈敏檢測奠定了研究基礎。
2、原文信息
Huang Y, Zhang L, Ji Y, Deng H, Long M, Ge S, Su Y, Chan SY, Loh XJ, Zhuang A, Ruan J.
A non-invasive smart scaffold for bone repair and monitoring.
Bioactive Materials. 19 (2023) 499-510.
