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嘉峪檢測網 2019-11-13 10:03
遺傳毒性試驗是采用哺乳動物或非哺乳動物細胞、細菌、酵母菌、真菌或整體動物測定試驗樣品是否會引起基因突變、染色體結構畸變以及其他DNA或基因變化的試驗。遺傳毒性試驗的主要目的是研究醫療產品導致人體基因改變，并能通過生殖細胞傳遞至下一代的潛力。
遺傳毒性試驗用于檢測兩類主要的遺傳損傷：基因突變（點突變）和染色體損傷（結構畸變、數目畸變）。單一試驗無法檢測出所有相關遺傳毒性物質，通常進行一組試驗，試驗組合包括：細菌回復突變試驗，體外哺乳動物染色體畸變試驗，體外小鼠淋巴瘤TK試驗，體外哺乳動物細胞微核試驗。
如果按照以上進行遺傳毒性試驗且兩個體外試驗的結果均為陰性，則不需進行進一步的動物體內遺傳毒性試驗。如果任意體外遺傳毒性試驗的結果為陽性，則應進行體內誘變性試驗，否則推定為誘變物。應在體外試驗確定出的最適宜終點的基礎上選擇相應的體內試驗，通常采用的體內試驗有：嚙齒動物體內微核試驗，嚙齒動物骨髓中期分析，轉基因基因突變試驗。
本篇主要具體介紹細菌回復突變試驗和體外哺乳動物染色體畸變試驗兩種體外試驗，以及體外小鼠淋巴瘤TK試驗和體內哺乳動物紅細胞微核試驗。
細菌回復突變試驗
OECD 471給出的細菌回復突變試驗，經修改適用于醫療器械。在評估醫療器械的遺傳毒性潛力時，可以使用醫療器械材料、浸提液或提取及蒸發的殘留物
細菌選擇：使用指數生長晚期或穩定生長期早期的細菌培養物（約109個細胞/mL），培養溫度為37℃，推薦的菌株有鼠傷寒沙門氏菌TA1535，TA1537，TA97，TA97a，TA98和TA100，大腸桿菌WP2uvrA，WP2uvrA（pKM10l）。
樣品的準備：可溶解或懸浮在溶劑中的醫療器械或材料可直接用于測試；不溶于溶劑的醫療器械或材料可用浸提液作為受試樣品，受試浸提液應在制備后的24小時內使用。如可能，浸提液應在制備后立即使用，以防止吸附在提取容器上或發生其他組分變化。
試驗步驟：對于平板摻入法，在沒有代謝活化系統的情況下，將0.1ml的受試樣品、0.1ml的新鮮細菌培養物（含有至少108個活細胞）和0.5ml無菌緩沖液與2.0ml頂層瓊脂混合。
對于有代謝活化系統的試驗，將0.5ml含有足量線粒體后組分（體積分數為代謝活化混合物的5%至10%）的代謝活化混合物與細菌和受試樣品/受試溶液一起與頂層瓊脂混合（2.0 ml）。將每個管中的內容物混合并傾倒在最低營養瓊脂平板的表面，待頂層瓊脂凝固后再進行孵育。37℃孵育48h-72h。結束孵育后對每個平板中的回復突變菌落數進行計數。
自動菌落計數儀應采用一系列真實的手工計數平板進行校準，這些平板須涵蓋一定范圍的突變菌落，包括從極低到極高的數量和不同大小的菌落。數據應當以每個平板的回復突變菌落數來表示。同時還應當給出陰性（溶劑對照和未處理對照，如果有使用）和陽性對照平板上的回復突變菌落數。
應當給出受試樣品以及陽性和陰性（未處理和/或溶劑）對照的各個平板回復突變菌落計數、平均回復突變菌落數以及標準偏差。
細菌回復突變試驗的陽性結果表明該受試物能夠通過鼠傷寒沙門氏菌和/或大腸桿菌基因組的堿基置換或移碼突變而誘發點突變。陰性結果表明，在本試驗條件下，受試樣品不會誘發試驗菌株的突變。
體外哺乳動物染色體畸變試驗
OECD 473給出的體外哺乳動物染色體畸變試驗，經修改適用于醫療器械。在有和沒有代謝活化系統的情況下將細胞培養物暴露于受試樣品中，然后按照預定的時間間隔，用中期分裂相阻斷劑(如秋水仙堿)進行處理，然后收獲、染色，并用顯微鏡分析中期分裂相細胞存在的染色體畸變。
細胞選擇：倉鼠CHO、V79和CHL細胞系、其他哺乳動物的外周血淋巴細胞，培養溫度為37℃。
樣品準備：可溶解或懸浮在溶劑中的醫療器械或材料可直接用于測試，不溶于溶劑的醫療器械或材料可以使用浸提液作為受試樣品。受試浸提液應在制備后的24小時內使用。如可能，浸提液應在制備后立即使用，以防止吸附在提取容器上或發生其他組分變化。
試驗步驟：在首次實驗中，應在有和沒有代謝活化系統的情況下，用受試樣品對增殖期的細胞進行染毒，淋巴細胞應在刺激有絲分裂后約48h開始染毒。細胞暴露于受試樣品中3h-6h，并在染毒開始后約相當于1.5個正常細胞周期時采樣。通常用秋水仙堿處理細胞培養物1h至3h，收獲每個細胞培養物并單獨處理以制備染色體，染色體制備包括細胞的低滲處理、固定和染色。
實驗的單位是細胞，應評估具有染色體結構畸變的細胞百分比。應列出實驗和對照培養物中不同類型的染色體結構畸變的數量和頻率，記錄主要畸變實驗中同期測定的所有處理培養物和陰性對照培養物的細胞毒性，提供各個培養物的數據，所有數據都應以表格形式進行匯總。
體外染色體畸變試驗的陽性結果表明，受試樣品可誘發培養的哺乳動物體細胞發生染色體結構畸變。陰性結果表明，在本試驗條件下，受試樣品不會誘發培養的哺乳動物體細胞的染色體畸變。
問與答
Q:進行遺傳毒試驗時，是否需要同時做體外和體內動物試驗?
A:不需要，當兩個體外遺傳毒性試驗的結果均為陰性，則不需進行動物體內遺傳毒性試驗；如果任意體外遺傳毒性試驗的結果為陽性，則應進行體內誘變性試驗。
Q:體外試驗的結果為陽性時，是否需要做全部的體內動物毒性試驗？
A：不需要，當有體外毒性試驗的結果為陽性時，應在體外試驗確定出的最適宜終點的基礎上選擇相應的體內試驗。
Q：實驗室進行生物學評價遺傳毒性試驗時，一般應怎樣進行試驗？
A：實驗室一般先做細菌回復試驗和體外細胞染色體畸變試驗，或者細菌回復試驗和基因突變試驗，如果兩組試驗中出現任意試驗陽性結果，再進行體內試驗：哺乳動物紅細胞微核試驗。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗
OECD 475給出的小鼠淋巴瘤TK試驗，即體外哺乳動物細胞基因突變試驗，包括檢測大克隆和小克隆，經修改后適用于醫療器械。胸苷激酶（TK）豐富的細胞對嘧啶類似物三氟胸苷(TFT)敏感，會導致細胞代謝受到抑制并停止進一步的細胞分裂。突變細胞能夠在TFT存在的情況下增殖，而含有胸苷激酶的正常細胞則不能。
細胞選擇：試驗中使用的是小鼠淋巴瘤細胞L5178Y TK+/-的亞克隆細胞，應得到目標細胞系且有足夠的細胞性能，檢查細胞是否有支原體污染，如果細胞被污染，則不應使用。培養基的滲透壓和pH值應在生理范圍內。
可溶解或懸浮在溶劑中的醫療器械或材料可直接用于測試。不溶于溶劑的醫療器械或材料可以使用浸提液作為受試樣品，提取方法的選擇取決于從受試樣品中獲得的可提取物的百分比。
試驗步驟：確定每種受試培養物和對照培養物的細胞毒性，在采用軟瓊脂法進行小鼠淋巴瘤試驗（MLA）時，使用相對總生長率（RTG）來進行測定。采用微孔檢測方法時，使用相對存活率（RS）作為細胞毒性指標時。無論使用何種試驗方法，均應使用相同的細胞毒性測量指標
在染毒期結束時，對細胞進行洗滌和培養，以測定存活率。通常在處理期之后開始通過測定培養物的相對存活率（RS）或相對總生長率（RTG）來檢測細胞毒性。在軟瓊脂法中，突變頻率（MF）是通過計數TFT抗性集落的數量并對選擇性培養基中的接種細胞數用平板接種效率（PE）進行校正后確定的，即MF＝（突變體數/接種的細胞數）×PE。對于微孔法，使用泊松分布計算平板接種效率（PE）和突變頻率（MF），然后計算突變頻率：MF = [PE（突變）/ PE（生存）] x 106。
體外哺乳動物細胞基因突變試驗的陽性結果表明，該受試樣品可誘發所用的培養哺乳動物細胞的基因突變，具有可重復的正向濃度-反應關系是最有意義的。陰性結果表明，在本試驗條件下，受試樣品不會誘發所用的培養哺乳動物細胞的基因突變。
體內哺乳動物紅細胞微核試驗
體內哺乳動物紅細胞微核試驗適用于采用OECD474進行檢測的醫療器械，通過適當的途徑使動物暴露于受試樣品中；如果使用骨髓，則在染毒后的適當時間處死動物，提取骨髓，并制備涂片（玻片）并染色。當使用外周血時，則在染毒后的適當時間收集血液，并進行涂片制備和染色。對于采用外周血進行的研究，最后一次染毒與細胞收獲之間的間隔時間應盡可能短，分析制片中存在的微核。
動物選擇：如果使用骨髓，建議使用小鼠或大鼠，也可以用其他合適的哺乳動物。當使用外周血時，建議使用小鼠；健康的初成年動物被隨機分為對照組和處理組。
試驗步驟：根據合適的染毒方案進行染毒，生理鹽水可以靜脈內注射，小鼠最高20 ml/kg，大鼠最高10 ml/kg；有機溶媒或提取物可采用腹腔注射，小鼠的劑量可以是20 ml/kg，大鼠可以是10 ml/kg。
對于骨髓和外周血，采用鏡檢方法，每只動物至少計數2000個嗜多染紅細胞（RET）或網狀紅細胞（RET），以計算有微核的嗜多染紅細胞（MN-PCE）/網織紅細胞（MN-RET）的發生率。
對于外周血，使用細胞計數法，對每只動物計數約20000個網織紅細胞（不成熟紅細胞）。通過對存在微核的正染紅細胞（NCE）（MN-NCE）進行計數，可以獲得其他信息。
每只動物的骨髓數據應以表格形式列出，實驗單元是動物，對于每只雄性和雌性動物，應記錄以下數據：嗜多染紅細胞的數量、正染紅細胞的數量以及有微核的嗜多染紅細胞和有微核的正染紅細胞的數量。應對每只動物計算嗜多染紅細胞占總紅細胞的比例（PCE/EC比值）。匯總表應顯示每個處理組在每個采樣時間的有微核的嗜多染紅細胞的組發生率、有微核的嗜多染紅細胞的平均發生率以及嗜多染紅細胞占總紅細胞的比例。
受試樣品中有微核的嗜多染紅細胞的發生頻率增加，則出于質量控制目的，可以對有微核的正染紅細胞進行計數，因為任何給定玻片中的偽象會使正染紅細胞和嗜多染紅細胞的“微核”發生率都明顯增加，也可以將有微核的正染紅細胞的平均發生率制成表格。
陰性結果表明，在本試驗條件下，受試樣品不會引起受試動物的不成熟紅細胞產生微核。
如果不符合陽性或陰性遺傳毒性反應的標準，則結果可被判定為模棱兩可或不確定，應進行進一步的試驗，并且最好采用調整過的實驗條件。可以從每只處理動物和對照動物中獲得額外的PCE（+2000）計數結果，以確證結果。
問與答
Q：進行遺傳毒試驗時，是否需要同時做體外和體內動物試驗?
A:不需要，當兩個體外遺傳毒性試驗的結果均為陰性，則不需進行動物體內遺傳毒性試驗；如果任意體外遺傳毒性試驗的結果為陽性，則應進行體內誘變性試驗。
Q:體外試驗的結果為陽性時，是否需要做全部的體內動物毒性試驗？
A：不需要，當有體外毒性試驗的結果為陽性時，應在體外試驗確定出的最適宜終點的基礎上選擇相應的體內試驗。
Q：實驗室進行生物學評價遺傳毒性試驗時，一般應怎樣進行試驗？
A：實驗室一般先做細菌回復試驗和體外細胞染色體畸變試驗，或者細菌回復試驗和基因突變試驗，如果兩組試驗中出現任意試驗陽性結果，再進行體內試驗：哺乳動物紅細胞微核試驗。
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