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嘉峪檢測網 2020-03-06 14:55
摘要：
伴隨大量創新及仿制藥面世而來的是對遺傳毒性雜質加強監管的迫切需求。一系列與國際接軌的指南性文件的出臺，彌補了我國雜質監管的空白，但難點尚存。傳統評價方法具有局限性，新方法與傳統方法間缺乏一致性比較，藥物特定合成路線實際產生的大量含警示結構雜質缺乏毒理學評價數據支持，毒性預測軟件的預測效力不足等。本文就國內外雜質遺傳毒性雜質監管科學現狀、遺傳毒性雜質控制策略、雜質遺傳毒性評價方法進行論述，并提出充分結合計算機毒理學、毒性評價方法和符合我國國情的監管限度制定三個維度開展雜質監管工作。
關鍵詞：雜質 遺傳毒性 評價方法 警示結構 細菌回復突變試驗 Pig-a基因突變試驗
2018年7月6日，浙江華海藥業公布其抗高血壓藥物纈沙坦的原料藥中發現遺傳毒性雜質(Genotoxicity Impurity)N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)的含量超過限值。NDMA作為N-亞硝胺類化合物，被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為2A類致癌物，少量攝取即存在誘發腫瘤的風險。2018年7月23日，華海藥業迅速完成國內纈沙坦原料藥的召回。2018年7月29日，原國家食品藥品監督管理總局新聞發言人對華海藥業NDMA雜質事件作情況說明。2018年8月17日，國家藥典委員會對纈沙坦的國家標準進行修訂并指出必須對生產工藝進行評估以確定形成N-亞硝基二甲胺的可能性。此事在國內引起軒然大波，并再次喚醒公眾對遺傳毒性雜質監管的重視。在事件的持續發酵過程中，華海藥業股價連續跌停，年度凈利潤下滑78.4%，累計計提損失超過4億元。華海藥業并非第一家涉及遺傳毒性雜質管控事故的廠家，也絕非最后一個。2007年，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)發現抗艾滋病藥物Viracept中含有的遺傳毒性雜質甲磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate，EMS)超出限定值，從歐洲市場召回[1]。2019年6月，美國麥克勞德制藥(Macleods Pharmaceuticals)生產的2批次氯沙坦鉀片和30批次的氯沙坦鉀/氫氯噻嗪片也因檢出超量NDMA而自愿從市場召回[2]。一系列藥品召回事件造成惡劣社會影響，并不斷敲響藥物雜質毒性監管的警鐘。
1 國內外遺傳毒性雜質監管現狀
藥品在生產合成和貯運過程中可能引入對人體有害的雜質，其中一部分具有遺傳毒性風險的成為遺傳毒性雜質。后者在很低濃度下即可誘導基因突變和染色體損傷，甚至導致癌癥并危及生命[3]。遺傳毒性雜質本質上是藥物生產或保存過程中難以避免，甚至不可避免的產物。制藥企業在藥物研發過程中，通常需花費大量時間和財力來驗證合成過程中不存在有遺傳毒性風險的產物。遺傳毒性雜質的出現也對監管機構提出了新的要求和挑戰。然而，遺傳毒性雜質的監管起步較晚，自2000年以后才陸續受到各國的重視。近年來，歐盟、美國藥品監管機構相繼發布了遺傳毒性和致癌性雜質的指導原則。如EMA人用藥委員會安全工作組(Committees for Human Medicinal Products，CHMP)于2004年發布《遺傳毒性雜質限度指南》并首次提出毒理學相關閾值(Threshold of Toxicological Concern，TTC)限度的概念[4]；美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)于2006年發布《原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質推薦方法》并提出使用決策樹(Decision Tree)法對雜質風險進行評估[5]；人用藥品注冊技術要求國際協調會(International Council for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH)在2017年發布的ICH M7指導原則中為遺傳毒性雜質的確認、研究和控制方法提供了指導性的建議和技術要求[6]。ICH M7的頒布具有里程碑式的意義，它將取代EMA遺傳毒性雜質限度指南和美國FDA遺傳毒性雜質指南草案，成為今后國際上廣泛通行的遺傳毒性雜質控制指導性文件。原國家食品藥品監督管理局于2017年成為ICH正式成員，我國相關標準和指導原則已與國際接軌。《中華人民共和國藥典》 (以下簡稱《中國藥典》)2015年版四部中已收載了《藥品雜質分析指導原則》，國家藥典委員會于2019年及時發布了《遺傳毒性雜質控制指導原則》 (征求意見稿) [7]，當前，國家藥品監督管理局正在推進ICH M7在我國的落地與轉化。一系列指南性文件的出臺彌補了我國與先進國家和組織之間的貿易與技術壁壘。
2 遺傳毒性雜質控制策略
致癌性風險在藥物研發階段即受到高度重視，通常會在研發早期開展基因突變遺傳毒性標準組合試驗對其致癌風險進行評估，而有潛在風險的化合物則及早停止研發。雜質因其特性有可能無法從藥物中去除，故根據人體暴露情況設置定量限成為可行的監管方略。EMA于2006年首先在遺傳毒性雜質監管中引入化學物質慢性毒性研究的毒理學相關閾值概念，在700余種致癌物分析基礎上，提出以1.5μg·d-1為有潛在遺傳毒性風險的化合物的TTC[8]。該暴露水平下，人體終生服用該物質的患癌可能性為十萬分之一。美國藥品研究和制造商協會(The Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRMA)進一步對建立暴露時間與TTC之間的關聯，建立“分期TTC [9]”。此外，PhRMA率先提出了雜質遺傳毒性五分類的概念，并以構效關系(Structure-activity Relationship，SAR)為分類依據，根據警示結構預測其誘導人體腫瘤的風險[9]。從而將化合物結構作為堿基插入導致的突變和腫瘤形成的重要決策基礎，而評估堿基突變風險的試驗方法也在分類中有重要權重。“分期TTC”和五分類決策樹的概念對全球藥品雜質監管影響深遠，美國FDA的《遺傳毒性雜質指南草案：原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質》、ICH M7及我國的《遺傳毒性雜質控制指導原則》相繼沿襲，是當前雜質監管領域的主要思路。值得注意的是“分期TCC”的具體限量在不同指南及法規中有所不同，如表 1所示，我國則以ICH M7為制定監管標準的重要依據。本文以ICH M7為藍本就雜質監管要求作簡要介紹。
表 1 不同指南及法規關于單個雜質服用時間與TTC限量對比
ICH M7主要適用于DNA反應活性雜質，即在含量很低時便存在致堿基突變及誘發人體腫瘤的風險。遺傳毒性雜質毒性的確認及定量構效關系(Quantitative Structure-activity Relationship，QSAR)數據庫的構建均以毒性研究數據為基礎。根據致突變和致癌風險危害程度，ICH M7將所有雜質歸為5類并提出相關控制策略[6]。1類雜質：已知具有致突變性的致癌物。對于該類雜質，首先考慮去除雜質，如果無法去除，則應建立基于未觀察到作用水平(No Observed Effect Level，NOEL)致癌性數據的限度數值。2類雜質：致癌性未知的已知致突變物。如存在閾值相關機制，以每日允許暴露量(Permitted Daily Exposure，PDE)求限度值；如無閾值相關機制的證據，根據TTC確立限度。3類雜質：含警示結構、與原料藥結構無關且無致突變性數據的物質。根據TTC確定限度值，或根據致突變性試驗評價結果歸為2類雜質或5類雜質并作相應控制。4類雜質：含警示結構、與原料藥或原料藥相關物質的警示結構相同，且經測試認為無致突變性的物質；按5類雜質(普通雜質)控制。5類雜質：無警示結構，或有充分的數據證明警示結構無致突變性或致癌性的物質。按普通雜質控制。
判斷某個雜質是否屬于遺傳毒性雜質時，首先應收集其相關細菌回復突變試驗、動物和人體致癌性數據。部分公開致癌性數據庫[10]如表 2所示。
表 2 常用化合物致癌性數據庫信息
2.1 已有致癌性或致突變性試驗數據的雜質控制
雜質具有已知致突變性或致癌性數據歸為1類致癌物，根據半數致癌劑量(MedianToxic Dose，TD50)線性外推法對其進行控制，即以誘導50%腫瘤發生率的劑量的五萬分之一為攝入量，可將腫瘤的發生風險控制于十萬分之一。致癌性強度數據庫(Carcinogenicity Potency Database，CPDB)中已明確列出1547種致癌物的TD50值供公開查詢。在測定TD50時，應以單一動物種屬和單一性別特定器官的最低TD50為準。無致癌性試驗數據的物質，歸為第2類或第3類的雜質，服用時間超過10年的藥物，單一雜質的攝入量為1.5 μg·d-1，可以應用TTC作為大多數毒性化合物作為可接受攝入量的默認值[11]。如原料藥質量標準中存在兩個2類或3類雜質，應制定各自限度值；如果含3種或更多的2類或3類雜質，可按多個雜質的總可被接受攝入量(服用時間超過10年的藥物雜質5 μg·d-1)計算(如表 2)。值得注意的是，1類雜質和制劑中形成的降解產物應單獨控制，不計入2類和3類雜質的總限度值。黃曲霉素類物質、N-亞硝基化合物和偶氮類等強致突變性化合物屬于關注隊列(Cohort of Concern，COC) [6]，TTC法對該類化合物不適用，其TD50應低于1.25 mg·(kg·d) -1。某些DNA反應性化合物可能受到某種代謝或調控通路影響，其實際閾值或攝入量與致癌性呈非線性關系，如乙基甲烷磺酸鹽、過氧化氫、苯胺類化合物等，可使用NOEL或PDE[計算公式：(NOEL×體質量)/(動物與人用劑量差異系數×不同人體之間差異×研究時間系數×嚴重情況系數×觀察到反應的最低劑量)]確定限量值(如表 3所示) [6]。
表 3 ICH M7中TTC法控制遺傳毒性雜質限度[6]
2.2 無已知致突變性及致癌性試驗數據的雜質控制
絕大多數雜質缺乏充分的遺傳毒性和致癌性研究數據，往往難以歸類。遺傳毒性的“警示結構”指雜質中的某些特殊基團或亞單位可與遺傳物質發生化學反應，從而導致基因突變或染色體重排/斷裂，具有潛在致癌風險。而產生遺傳毒性致癌性的化合物，從作用機制上分析均具有DNA反應活性，通過與遺傳物質發生化學鍵合引起遺傳信息改變產生致癌性，而基因突變往往是遺傳毒性致癌性作用的起始環節[12-13]。Ashby和Benigni等根據高DNA反應活性可以認為是堿基突變及腫瘤形成最初階段的原理，歸納并提出了18種化學結構的“警示結構(Alert Structure)”模型，包括酰鹵、烷基或苯基磺酸酯、烷基或苯基磷酸酯、N-羥甲基衍生物、單鹵代烯烴、硫芥、氮芥等[14]，如圖 1所示。隨后，在國際上提出采用“警示結構”作為區分普通雜質和遺傳毒性雜質的重要依據的概念。這一概念已廣泛應用于遺傳毒性和致癌性預測軟件，也成為遺傳毒性警示結構以及QSAR模型的基礎。對于存在“警示結構”的雜質進行QSAR預測和體內外相關研究，或將其含量控制在一定范圍之內。當前已有多種計算機軟件可對化合物的遺傳毒性進行預測，如基于文獻報道和專家知識的預測軟件Toxtree(Joint Research Centre of European Chemical Bureau)、Derek Nexus(Lhasa Limited)和基于統計學的預測軟件如Sarah Nexus(Lhasa Limited)和CASE Ultra(MultiCase Inc.)等。這些預測決策樹或根據既往Ames試驗或微核試驗等遺傳毒性試驗數據，或根據警示結構的遺傳毒性陽性可能性來生成判斷結果。
圖 1 含有多種“警示結構”的超級致癌物的提出[12]
然而，現有數據庫在預測效力上存在一定局限性。新藥研發催生大量新型有效藥物成分(Act ive Pharmaceutical Ingredient，API)和新型合成路線的誕生，現有的數據庫信息與浩如煙海的雜質種類相比乃九牛之一毛。一項針對十余家跨國藥企百余種合成路線產生的雜質的研究中共發現600多種警示結構，其中烷化劑、芳香胺、酰胺類及芳香硝基衍生物類警示結構占總警示結構的61.3%[15]。值得關注的是含酰氯衍生物、烷基醛及硼酸類警示結構的化合物在該研究中占總警示結構的5.8%、4.7%和3.5%，但在已知致癌信息數據庫中僅占0.5%、0%和0%。故上述警示結構的化合物的致癌性有必要進行試驗研究。此外，含有“警示結構”的化合物并非一定具有遺傳毒性。以常用解熱鎮痛藥對乙酰氨基酚(4-Acetamidophenol/N-acetylp-aminophenol，APAP)為例，2011年國家藥品抽檢的APAP藥品中含有多種苯酚類雜質，基于決策樹的毒性預測平臺Toxtree預測其中絕大多數含有遺傳毒性致癌性警示結構、多數含Ames致突變性試驗陽性警示結構和體內微核試驗陽性警示結構，如表 4所示。然而，實際臨床及動物長期研究數據并不提示APAP存在致癌性。再以ICH M7推薦使用的毒理學數據庫Derek Nexus為例，其對截至2005年已有206種化合物的預測結果的一致性為86%，靈敏性為73%；而對2005-2011年間新增的化合物的預測度的一致性為89%，靈敏度降低至50%[16-17]。比如，Derek Nexus對4-氯乙酰基乙酰苯胺的致突變性預測結果為陰性，然而在多個實驗室共同開展Ames試驗聯合驗證工作中均得到明確陽性結果[18]。預測靈敏度的降低提示存在致突變風險的化合物無法通過軟件預測的方法獲知，監管工作中僅憑借構效分析軟件預測結果仍然存在風險。此外，某些創新藥的化學結構可能難以通過數據庫進行預測。無論基于經驗或統計學的數據庫的構建，其預測結果的準確度都極大程度上依賴于真實的試驗數據。可見開展試驗研究對雜質毒性評價具有重要價值。
表 4 Toxtree對乙酰氨基酚及其雜質遺傳毒性預測結果
3 藥物雜質致突變性評價方法
由遺傳毒性發生的機理可知，基因突變是腫瘤發生的分子基礎。以堿基突變為評價終點的Ames試驗和體內Pig-a基因突變試驗，均作為雜質遺傳毒性風險評價的首選試驗方法[6]，其試驗數據已獲得FDA認可。評價受試物與DNA作用風險的彗星試驗結果對雜質遺傳毒性評價也有一定參考。雜質毒性評價的另一大難題，是可合成或獲取的雜質量難以滿足試驗需要，而ICH M7要求盡量使用雜質純品開展評價；此外，單一化合物可能有10~20余種雜質。受試物需求量少、試驗周期短的快速評價方法才能滿足大量雜質遺傳毒性評價的迫切需求，故有必要優化和改進傳統遺傳毒性評價方法。
3.1 Ames試驗
細菌回復突變試驗(Bacterial Reverse Mutation Test，Ames)，1970年由Bruce. N. Ames[19]使用組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株(S.Typhimurium)建立，故命名為Ames試驗。該試驗利用缺乏合成組氨酸能力的細菌在可誘導堿基突變的化合物的作用下可通過發生回復突變，從而自行合成組氨酸來形成大量肉眼可見的菌落的原理，通過菌落計數來評價受試物的堿基突變能力。該方法是當前所有遺傳毒性評價方法中對致癌物預測度最高的試驗，Ames試驗對大鼠致癌物和恒河猴致癌物的檢出率分別為69.0%和87.5%，也是化合物QSAR構效關系建立的遺傳毒性篩選數據庫的重要基礎[20]。
隨著分子生物技術發展的飛躍，Ames作為一項經典的致突變性篩選方法經歷了一系列改良，比如微孔板、液態培養法或引入含熒光報告基因等[21-22]。ICH M7認可基于標準平皿的Ames試驗數據。但某些雜質合成困難，基于微孔板的Ames試驗，如Mini-Ames(6孔板)或Micro-Ames(24孔板)在不改動傳統Ames試驗原理的條件下可減少雜質的用量，極具應用潛力。OECD正在對Ames試驗指導原則進行修訂，并于2018年在國際范圍內收集Mini-Ames、Micro-Ames和Ames波動試驗的背景數據，試圖形成標準化的操作流程。然而非標準平皿的Ames試驗各家實驗室操作流程差異很大，較難形成統一操作標準，可能對審評工作造成一定難度。開展相關試驗方法與傳統試驗方法結果的一致性比較則有助于數據互認和評價效率。筆者完成的Ames與Mini-Ames試驗中陰性與陽性對照組回復突變菌落數比較如表 5所示。
表 5 標準平皿Ames與Mini-Ames試驗回復突變菌落數(個/皿，x±s)
3.2 Pig-a基因突變試驗
體內Pig-a基因突變試驗是近年來在藥物安全性評價領域日益受到重視的一項藥物致突變性評價方法。Pig-a基因位于X染色體，該基因突變可導致糖化磷脂酰肌醇(Glycosylphos-phatidyl Inositol，GPI)合成障礙，從而使相關細胞GPI錨蛋白(如CD48、CD55、CD59等)缺失。因GPI錨蛋白在不同物種間的生物合成高度保守，且在各類組織細胞及各類成熟紅細胞中均有表達，故試驗可使用正常動物外周血作為試驗系統[23]。Araten等[24]在1999年首次提出Pig-a基因突變試驗可用藥物基因突變風險評價。Dertinger等[25]進一步將高通量免疫磁性篩選技術引入Pig-a基因突變試驗，有效提高了統計功效。該方法當前已完成多中心聯合驗證[25-26]，OECD擬于2020年正式發布相關指導原則。當Ames試驗結果不明確時，體內Pig-a基因突變試驗可作為后續選擇的試驗方法，其結果已獲得美國FDA認可。體內Pig-a基因突變試驗的主要優勢在于可檢測弱致突變劑體內蓄積后的致突變風險，并獲得受試物對嚙齒類動物致癌風險的相關數據。但其缺點也較為突出，即受試物需求量較大，試驗周期長，對于合成量較少的雜質來說存在一定困難，且不適合大量雜質毒性篩選。但體內Pig-a基因突變試驗尚未經過國內聯合驗證及推廣，實際上具有相關試驗能力和經驗的國內安全性評價中心很少。
近年來，國內外陸續開展基于TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動物細胞系的體外Pig-a基因突變試驗建立與驗證工作[27-29]。體外Pig-a基因突變試驗的優點是使用的受試物用量少、試驗周期短(一般受試物處理8天后檢測)、不使用動物和適于進行機制研究。但是，在安全評價領域正式使用之前，在細胞選擇和標準化試驗方法的驗證等方面還需要開展大量工作。體內及體外Pig-a基因突變試驗優劣對比詳見表 6。
表 6 體內及體外Pig-a基因突變試驗比較
3.3 彗星試驗
Ostling和Johansson[30]于1984年建立彗星實驗(Comet Assay)，也稱為單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE)，可在單細胞水平上檢測DNA鏈斷裂程度，從而評價受試物是否與DNA相互作用。該方法利用損傷的DNA與完整的DNA在電泳中遷移速率差異，對存在DNA損傷的細胞(形成彗星樣結構)進行區分。因DNA斷裂多在給藥后短期內出現，該方法可靈敏地檢出短時間內出現的DNA損傷。但DNA單鏈斷裂可自行修復，損傷不一定遺傳給子代細胞。故彗星試驗的結果可作為參考，用于判斷受試物與DNA堿基作用的可能性，其結果對雜質的遺傳毒性有一定預測作用。國際肝細胞彗星試驗實驗室間聯合驗證于2015年完成并發表[31]，OECD于2014年頒布體內彗星試驗指導原則[32]。
4 小結
綜上所述，隨著大量創新藥及仿制藥的出現，迫切需要加強遺傳毒性雜質的監管。我國已陸續出臺了一系列與國際接軌的指南性文件以支持雜質的毒性評估，但實際工作中難點尚存。如傳統方法在雜質評價中存在局限性，指南性文件對雜質的遺傳毒性評價要求不明確，缺乏新方法與傳統方法之間的一致性比較，藥物合成路線實際產生的大量含警示結構雜質無毒理學研究數據支持，基于構效分析的毒性預測軟件的預測效力不足等。此外，通過對國家藥品抽檢數據庫與歐洲藥典分析比對，我國國抽藥品實際檢出雜質與歐洲藥典中所列出的雜質類型存在較大差異，其原因可能與藥物合成加工方式不同有關。我國藥典中對藥品可能存在的雜質和具體定量限要求缺乏詳細明確的界定，而歐洲藥典中的雜質毒性及定量限的信息又難以借鑒。上述因素對監管人員在藥物化學、遺傳毒性評價等多領域的知識儲備提出了新的挑戰。遺傳毒性雜質的監管不是紙上談兵，應充分結合計算機毒理學、毒性評價方法和制定符合我國國情的監管限度值，從三個維度切實做好雜質的控制，從而提高藥物的安全性，保障人民用藥安全。
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作者：文海若, 閆明, 王亞楠 1, 王翀 3, 耿興超 1, 朱炯 3, 張河戰, 王雪
1. 中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監測中心, 藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室, 北京 100176;
2. 中國藥科大學, 南京 210009;
3. 中國食品藥品檢定研究院技術監督中心, 北京 102629
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