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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-05-07 16:00
摘要 目的：建立反相高效液相色譜法測定苯丙氨酯及其片劑的有關物質(zhì)和含量。方法：采用Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(60∶40)為流動相，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為259nm，柱溫為40℃，進樣量為20 μL。結果：有關物質(zhì)線性范圍為 0.51～30.24μg·mL-1，r=0.999 9，檢出限為4 ng，精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD≤0.8%；含量測定線性范圍為12.60～100.82μg·mL-1，r=0.999 9；苯丙氨酯片的平均回收率為99.7%，RSD=0.6%(n=9)；原料含量測定結果為99.3%～99.8%；片劑含量測定結果為99.0%～103.6%。結論：本法簡便、準確、專屬性好、靈敏度高，可用于苯丙氨酯及其片劑的質(zhì)量控制。
關鍵詞：苯丙氨酯；高效液相色譜法；有關物質(zhì)；含量測定；質(zhì)量控制
苯丙氨酯是一種具有鎮(zhèn)靜作用的中樞性骨骼肌松弛劑，臨床上主要用于腰背、四肢肌腱炎、韌帶損傷、肌肉緊張痛、神經(jīng)痛及風濕性關節(jié)炎的治療[1]。本品治療效果顯著，且無非甾體類抗炎藥的嚴重不良反應，目前國內(nèi)有多家企業(yè)生產(chǎn)，其中原料生產(chǎn)廠家有3家，片劑生產(chǎn)廠家有38家。苯丙氨酯現(xiàn)行標準含量測定方法為氮測定法[2]，片劑含量測定方法為紫外分光光度法[2]和氮測定法[3]。采用氮測定法，試驗步驟較為繁瑣；采用紫外分光光度法，由于采用乙醇為配制溶劑，其揮發(fā)性較大，測定結果受實驗室溫濕度等試驗環(huán)境的影響較大，易造成測定結果的不準確性。鑒于本品現(xiàn)行標準為《中華人民共和國藥典》1995年版，測定方法具有上述缺陷且均無有關物質(zhì)檢查項等問題，國家藥典委員會將其列為國家藥品標準提高工作，天津市藥品檢驗研究院承擔苯丙氨酯及其片劑質(zhì)量標準的修訂起草工作，本文擬建立同時測定苯丙氨酯及片劑含量和有關物質(zhì)的HPLC方法[4]。
1 材料
LC-20A型高效液相色譜儀①；1200型高效液相色譜儀②；AE-240型電子天平(瑞士MettlerToledo公司)；AS 10200A型超聲儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。
苯丙氨酯對照品；苯丙氨酯(東港市某公司提供，批號：150901、170103、170306)；苯丙氨酯片(規(guī)格：200mg，由天津某藥廠提供，批號：02160208、02160209、P0214039)；甲醇為色譜純，水為純化水。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱：①Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；②Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；③Dikma Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；除片劑有關物質(zhì)空白輔料影響試驗和耐用性試驗外，其他試驗均采用儀器①和色譜柱①；流動相為甲醇-水(60∶40)；檢測波長為259 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL。
2.2 溶液的制備
2.2.1 供試品溶液a(有關物質(zhì))
取本品原料約50 mg(或相當于苯丙氨酯約50 mg的片粉)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻(片劑溶液濾過后取續(xù)濾液)(1.0 mg·mL-1)。
2.2.2 對照溶液(有關物質(zhì))
精密量取“2.2.1”項下供試品溶液a 1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.2.3 靈敏度測試溶液
精密量取“2.2.2”項下對照溶液1 mL，置20mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.2.4 空白輔料溶液
按天津某藥廠提供的處方比例，照供試品溶液a 配制方法配制不含主成分的輔料溶液。
2.2.5 供試品溶液b(含量測定)
取本品原料約50 mg(或相當于苯丙氨酯約50 mg的片粉)，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻(片劑溶液過濾后取續(xù)濾液)，精密量取5mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻(50 μg·mL-1)。
2.2.6 對照品溶液(含量測定)
精密稱取苯丙氨酯對照品適量，加流動相溶解并定量稀釋制成50 μg·mL-1的溶液，搖勻，即得。
2.2.7 專屬性試驗儲備液
精密稱取原料藥(或片粉)適量，加流動相溶解并定量稀釋制成10 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗
取對照品溶液進樣測試，按苯丙氨酯峰計算理論板數(shù)為14588，拖尾因子為1.1。按“2.1”項下進樣、測定、記錄色譜圖。對照品溶液、供試品溶液a、b及空白溶劑的色譜圖見圖1，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。
2.4 專屬性試驗
2.4.1 破壞試驗
取“2.2.7”項下專屬性試驗儲備液各5份，每份1mL，分別進行如下處理。(1)酸破壞：加鹽酸溶液1mL，振搖30 min后，用氫氧化鈉試液調(diào)pH為中性，加流動相稀釋至10mL(片粉溶液需過濾，以下同)；(2)堿破壞：加氫氧化鈉試液1mL，振搖30 min后，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)pH為中性，加流動相稀釋至10mL；(3)氧化破壞：加30%過氧化氫溶液1mL，沸水浴中加熱15 min，放冷至室溫，用流動相稀釋至10 mL；(4)光照破壞：光照7 d，加流動相稀釋至10mL；(5)熱破壞：加流動相適量，沸水浴中加熱1 h，放冷至室溫，加流動相稀釋至10 mL。分別取上述溶液20μL，按“2.1”項下的色譜條件進樣、測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍，詳見圖2。結果表明：在上述條件下，原料及片劑供試品溶液在酸、堿、光、熱的破壞條件下基本穩(wěn)定，均未見明顯增加的雜質(zhì)色譜峰，在氧化加熱的條件下產(chǎn)生降解雜質(zhì)，各雜質(zhì)峰之間、與主峰之間基本可達到基線分離，說明擬定的色譜條件專屬性良好。
A.空白溶劑(blank solution) B.對照品溶液(reference solution) C.供試品溶液b(sample solution b) D.供試品溶液a(sample solution a) 1.苯丙氨酯(phenprobamate)
圖1 高效液相色譜圖
2.4.2 輔料干擾試驗
取“2.2.4”項下空白輔料溶液20 μL，分別采用以下三種色譜條件，即色譜條件A：儀器①色譜柱①；B：儀器①色譜柱②；C：儀器②色譜柱③，其他按“2.1”項下的色譜條件，進樣，記錄色譜圖，結果顯示，在上述色譜條件下，主峰的相對保留時間為0.4之前均產(chǎn)生若干輔料峰，保留時間最大的輔料峰的相對保留時間均為0.4，按自身對照法計算，總輔料量約為0.5%。原料及片劑共6批樣品在輔料峰處均未檢出雜質(zhì)色譜峰，且專屬性試驗的各種破壞條件下亦未在輔料峰處檢出明顯增加的降解產(chǎn)物峰，故在質(zhì)量標準中扣除主峰相對保留時間為0.4之前的色譜峰，以去除輔料對片劑有關物質(zhì)測定的影響。
2.5 線性關系考察
精密稱取苯丙氨酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成含苯丙氨酯0.5、1、2、5、10、20的系列濃度溶液(有關物質(zhì))和12.5、25、50、75和100μg·mL-1的系列濃度溶液(含量測定)，分別取20μL，按“2.1”項下條件進樣、測定、記錄色譜圖。以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸。(有關物質(zhì))和(含量測定)線性方程分別為：
Y=140 1X＋39.88 r=0.9999
Y=138 8X＋428.3 r=0.9999
結果表明：苯丙氨酯在0.51～30.24μg·mL-1和12.60～100.82 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好線性關系。
2.6 檢測限與定量限
取苯丙氨酯對照品適量，采用逐步稀釋法配制系列濃度的溶液，按“2.1”項下條件進樣、測定、記錄色譜圖。主成分峰信噪比S/N=10時，以此作為靈敏度測試溶液(0.05%)，最低定量限為10 ng；信噪比S/N=3時，最低檢出限為4 ng。
2.7 精密度試驗
取含量測定對照品溶液連續(xù)進樣6次，苯丙氨酯峰面積的RSD=0.2%，表明本系統(tǒng)精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗
取原料供試品溶液a和b，分別于室溫下放置0、2、8、12、24 h時進樣測定。供試品溶液a苯丙氨酯峰面積的RSD分別為0.4%(原料)和0.3%(片劑)；供試品溶液b苯丙氨酯峰面積的RSD分別為0.8%(原料)和0.5%(片劑)。結果表明有關物質(zhì)及含量測定供試品溶液均在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
A.空白溶劑(blank solution) B.原料供試液(phenprobamate solution) C.原料酸/堿/高溫/光照破壞(phenprobamate destroyed by acid/alkali/heat/light) D.原料氧化破壞(phenprobamate destroyed by oxidation) E.片劑輔料溶液(excipient solution)F.片劑供試液(phenprobamate tablets test solution) G.片劑酸/堿/高溫/光照破壞(phenprobamate tablets destroyed by acid/alkali/heat/light) H.片劑氧化破壞(phenprobamate tablets destroyed by oxidation) 1.苯丙氨酯(phenprobamate)
圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖
2.9 重復性試驗
取苯丙氨酯原料，分別按“2.2.1”和“2.2.5”制備供試品溶液a和b各6份，分別按“2.1”項下條件進樣、測定、記錄色譜圖。檢出有關物質(zhì)單個最大雜質(zhì)和雜質(zhì)總量結果基本一致；含量測定結果RSD=0.2%，表明方法重復性好。
2.10 片劑回收率試驗
稱取空白全輔料約0.25片量，共9份，分別置100 mL量瓶中，精密加入對照品約40、50和60 mg各3份，加流動相適量，振搖使溶解后用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別按“2.1”項下條件進樣、測定、記錄色譜圖。計算平均回收率為99.7%，RSD=0.6%(n=9)，表明方法準確度良好。
2.11 耐用性試驗
按“2.4.2”項下的三種色譜條件，分別對苯丙氨酯原料及片劑進行有關物質(zhì)和含量的測定，測定結果基本一致(見表1)，表明本方法的耐用性良好。
2.12 樣品測定
2.12.1 主藥含量測定
取原料藥及片劑各3批，按“2.2.5”項和“2.2.6”項下方法制備，取供試品溶液和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算含量，結果見表1。
2.12.2 有關物質(zhì)測定
取原料藥及片劑各3批，按“2.2.1”項下方法制備，取供試品溶液和對照溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，按主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量，結果見表1。
3 討論
3.1 供試液濃度的選擇[5]
以甲醇-水(60∶40)為流動相，首先按含量測定供試液濃度為0.5 mg·mL-1、有關物質(zhì)供試液濃度為2.5 mg·mL-1或5 mg·mL-1、以1%的稀釋溶液為自身對照進行考察，采用儀器①和上述3支色譜柱。結果顯示，高濃度供試液(2.5 mg·mL-1和5 mg·mL-1)色譜圖中，主成分色譜峰的峰形不對稱、拖尾嚴重，拖尾因子在3支色譜柱上均為1.3～1.4。經(jīng)調(diào)節(jié)流動相組成及比例亦不能有效改善該色譜峰的對稱性。將有關物質(zhì)供試液濃度調(diào)整為1.0 mg·mL-1，含量測定供試液濃度調(diào)整為50 μg·mL-1，以10 μg·mL-1的溶液作為1%的自身對照溶液，上述濃度的溶液在3支色譜柱上均峰形對稱性良好(拖尾因子≤1.2)，以0.5μg·mL-1的溶液作為靈敏度測試溶液(相當于0.05%)，主成分峰信噪比均＞10，可以滿足測定要求。
3.2 檢測波長的選擇
取濃度為1.0 mg·mL-1的供試液在200～400nm波長范圍內(nèi)掃紫外圖譜，顯示本品的最大吸收波長為259 nm；在上述液相色譜條件下苯丙氨酯的最大吸收波長亦為259 nm，故確定以259 nm作為測定波長。
3.3 測定時間的選擇
根據(jù)專屬性試驗的色譜圖及6批樣品有關物質(zhì)的測定圖譜，在記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍～4倍時，均未檢出雜質(zhì)色譜峰，故確定色譜圖的記錄時間為主成分峰保留時間的2倍。
3.4 與原標準測定方法的比較
本研究建立的RP-HPLC法較氮測定法操作更為簡便；較紫外分光光度法可避免揮發(fā)性溶劑所帶來的誤差，使測定結果更為準確。另外，現(xiàn)行標準均未控制雜質(zhì)含量，難以保證用藥安全，而本研究建立的有關物質(zhì)測定方法靈敏度高，可以準確測定雜質(zhì)含量。
3.5 小結
本方法簡便、準確，專屬性好，靈敏度高，可用于苯丙氨酯及其片劑的質(zhì)量控制。
參考文獻
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來源：中國藥品標準
