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嘉峪檢測網 2021-09-14 20:37
新藥研發必須遵守“安全、有效、質量可控”的基本原則。秉承“科學設計、規范生產、過程監控及制定合理的藥品質量標準”等原則能夠保證藥物的質量可控。在藥物質量研究過程中，除了關注活性成分的指標外，近年來對其雜質和有毒、有害物質的研究越來越重視[1]。藥物中的雜質簡單地可以分為有關物質（有機雜質）、殘留溶劑、金屬雜質、晶型雜質、異構體雜質、基因毒性雜質及其他一些特定的物質。這些物質一般沒有治療作用，有的還具有一定的毒性，尤其是基因毒性雜質，是影響藥物安全性的主要因素。藥品在臨床使用中產生的不良反應除了與藥品本身的藥理活性有關外，有時與藥品中存在的雜質也有很大關系。對于原料藥的雜質，一般來源于起始物料及反應容器、試劑、催化劑、反應溶劑、中間體、副產物等；而制劑中的雜質主要來源于輔料、溶劑、降解產物、包裝器皿中可提取或滲出的雜質等。中藥常見的雜質包括農藥殘留、重金屬殘留、黃曲霉素類、二氧化硫、大孔樹脂殘留溶劑等。抗生素類的藥物因來源復雜導致其雜質比較特殊。在國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心技術審評中，質量模塊較多的問題都聚焦在“雜質限度制定的依據或合理性”上，而“限 度制定”往往又是方法開發與驗證的前提，非常重要，本文綜述了近年來藥物中雜質及有害物質在設定控制限度方面的研究進展。
1、雜質限度閾值的設定
1.1指導原則
各國或組織就雜質的限度論證先后出臺了多項指導原則，核心是要求藥物中的雜質應該能夠被很好地控制，并盡可能地將其去除。雜質的研究也經歷了純度控制→雜質控制→雜質譜控制的階段。
1.2 雜質限度
人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）定義雜質的界定或論證為“雜質的界定是獲得和評估一些數值的過程，這些數值用于建立安全的閾值，單個的或某些已明確的雜質量在這個閾值水平下是可以確保生物安全性的。申報者應對所選定的雜質限度提供包括安全性研究在內的理由”。醫藥行業內一般可以從以下方面進行雜質的界定或論證：
（1）從臨床研究或預試驗研究的數據獲得；
（2）從科學文獻中獲得數據；
（3）該雜質也存在于已上市的產品中，間接證明；
（4）該雜質是活性成分的代謝物；
（5）如果是仿制藥，可以從比對的數據中尋找依據，如藥典限度、原研產品的限度；最好做到鑒定閾值以下，超過鑒定閾值雜質，在結構確認取得相應雜質對照品后，應用外標法重新定量，以判斷是否超過界定閾值。分析雜質的化學結構，看是否具有“警示結構或官能團”；
（6）進行雜質的毒理學研究。
在進行雜質限度的設定中，要充分考慮雜質毒理學研究的數據、藥品的適應癥、日劑量、治療持續的周期等方面。對于新原料藥和制劑的雜質控制限度可依據ICH。
ICH提供的雜質研究指南僅適用于化學合成的原料藥及制劑，不適用于生物制品、發酵或半合成產品、中藥以及來源于動植物的粗制品；不適用于從新藥制劑的輔料或包裝容器中滲出產生的雜質，不包括外源性污染物、多晶型和對映體雜質。
抗生素活性物質由化學合成工藝、發酵工藝或先采用發酵工藝，后采用一步或多步化學步驟（半合成物質）來生產，與合成工藝比較，發酵工藝更易于變異而不容易控制，其雜質分布情況可能更復雜和不可預測。
對于發酵類或半合成類抗生素藥物的雜質限度制定，EMEA出臺了相應的指導原則[7]。
1.3 常用的雜質限度計算公式或評估方法
日允許接觸劑量（PDE）即某物質被人或動物接觸后，任何反應頻率或嚴重性在生物學上無明顯增加的最高劑量。殘留溶劑限度計算的PDE公式中，如果未觀察到反應的劑量（NOEL）未知，可以用最低觀察反應劑量（LOEL）代替，即某種物質被人體或動物接觸后，任何反應頻率或嚴重性在生物學上明顯增加的最低劑量。NOEL的確定，一方面根據相應動物試驗的資料確定，另一方面可以參考網上的數據庫，另有文獻報道，NOEL可根據下列公式NOEL＝LD50×70/2 000計算。
毒理學關注閾值（TTC）是一種新的風險評估工具，有助于毒性的評估。TTC定義了一個安全的閾值水平，當人體暴露水平低于該閾值時，化合物不會產生明顯的致癌性或其他毒性反應。根據取得TTC值數據庫的性質，TTC原則不適用于評價重金屬（如砷、鎘、鉛和汞）、具有極端長半衰期和在生物累積過程中表現出很大的種屬差異的化合物、蛋白質。對于參數TD50，可以從試驗、文獻、網站等途徑獲得。如未有TD50報道，且未有特別說明，TTC可以制定為1.5 μg/d。
2、一些特定領域或典型物質的殘留限度的研究
2.1 基因毒性雜質
一般性的及ICH雜質研究指南并不適用于具有遺傳毒性或基因毒性的雜質。基因毒性的雜質應該在工藝路線中避免設計或產生，如果不可避免，應該將其降低到一定的限度。
EMEA、FDA等組織出臺了相關的基因毒性雜質控制的技術指南。對于短期用藥，見EMEA指南中的限度表 5。FDA接受EMEA上述指南，提出了臨床研究階段藥物的限度。
有些化合物，攝入量即便低于其TTC，其遺傳毒性也很強，如黃曲霉素類、N-硝基化合物、偶氮化合物等，需要進行雜質的毒理學研究。
中間體雜質有警示結構的，應分情況對待：
（1）如果原料也含有相同的結構（一般的抗腫瘤藥物），如卡培他濱，其中間體含有氨基甲酸酯的警示結構，那么原料成品中的中間體雜質可以按照ICH Q3A控制即可；
（2）如果原料不含有警示結構，而中間體有，則中間體在原料中的殘留情況需要按照基因毒性雜質控制，如某藥物合成時與對甲苯磺酸成酯，而經水解后脫掉對甲苯磺酸形成活性成分；
（3）合成路線中用到了磺酸或磷酸結構的物質如同時用到了低分子的醇，也要考慮成酯的情況是否會產生基因毒性雜質。
美國藥品研究和生產商協會PhRMA成立了一個工作小組來討論遺傳毒性雜質，成果以意見書的形式發表在《監管毒理學和藥理學》雜志中[46]，文件引入了兩個重要的創新理念，一是遺傳毒性雜質的五級分類系統，二是臨床試驗材料的分期TTC概念。基于該分類系統，該文件提出了一個雜質評估策略，成為業內大多遺傳毒性雜質相關風險評估的標準。分期TTC意味著可以根據劑量和臨床試驗的持續時間對其進行調整，使得劑量增加時TTC降低，持續時間較短時TTC提高。
綜合各類指導原則，對于基因毒性雜質的控制基本形成了以下思路：
（1）分析其合成路線，并利用遺傳毒性數據或警示結構存在與否鑒定潛在的遺傳毒性雜質。而TTC則是風險評估的最終決策依據。
（2）確認臨床試驗中短期用藥的每日允許攝入量。
（3）論證藥物基因毒性雜質殘留限度以使用嚴謹或更合理的閾值。
（4）將第一步中鑒定的雜質進行分類，并分別為每類進行限度論證。
2.2 殘留溶劑
在ICH及其他國家的指南中，藥物中的殘留溶劑分為3類；一類溶劑應避免使用；二類溶劑應限制使用，殘留量符合PDE；三類溶劑如暴露量不超過50 mg/d，那么對人體基本無危害。
實際應用中可以選擇不同的計算公式合理地擴大或緊縮限度。如乙腈的允許日接觸量為4.1 mg/d，假定日給藥劑量為10 g，由此計算的限度是4.10×10−4。現某片劑最大日劑量為5.0 g，含兩種輔料。
對于一些未列入ICH類別的溶劑，除了采用毒理數據計算外，也可以借鑒一些經驗數值：
（1）三乙胺在原料藥中的殘留量可以控制在3.20×10−4；
（2）對于ICH指出的二甲苯殘留，如未有特殊說明，可以計算鄰、間、對二甲苯殘留之和；
（3）石油醚是由低分子烷烴組成的混合物，其組成比例沒有確定性。在ICH指導原則和《中國藥典》2010年版附錄中都將石油醚列為沒有足夠毒性資料的第四類溶劑，要求藥品生產企業在使用時應提供該類溶劑殘留水平的合理性論證報告。文獻報道，以石油醚的各主要組分峰面積的加和計算方式來表示石油醚的殘留量，可以有效控制石油醚在藥物中的殘留量[50]；
（4）對于大孔樹脂的溶劑殘留量，苯乙烯骨架型大孔吸附樹脂殘留物檢查項目暫定為[51]：苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、烷烴類、二乙基苯類（二乙烯基）等殘留物的限度定為苯小于2×10−6、其他小于2×10−5。但是，應用大孔樹脂的藥品安全性也同其他藥品一樣，在上市前應根據臨床前和臨床安全性研究的情況綜合評價，也可以參考ICH，同時考慮給藥途徑等因素；
（5）對于殘留溶劑色譜圖中的未知峰，可制訂限度不得過0.1%。
2.3 重金屬
重金屬雜質是一類自然存在的雜質，可能是工藝需要有意使用了金屬化合物或在生產現場接觸到金屬元素，導致在終產品中殘留。如基于安全性和質控的需要，原料或輔料合成中用到的金屬催化劑或金屬試劑，如鈀、鉑、鋅、鐵、鉻等需要進行嚴格控制。
對于藥物中常規性的重金屬檢查，各國藥典均制定了比色法進行半定量控制，即在pH 3.5條件下，通過硫離子或其他試劑與鉛、銅、銀、汞、鎘等重金屬離子反應生成黑色硫化物沉淀。通過與含有已知量鉛的對照溶液的比較進行樣品的重金屬檢查。盡管本方法對不同重金屬的靈敏度不同，但總的“重金屬”量是以鉛量計。2011年版《歐洲藥典》指出了不同情況下的重金屬殘留限度。
但是，經典的重金屬限度檢查法存在一定的局限性，體現在以下幾個方面：（1）常規法基于目測比較，誤差較大；（2）常規法是基于供試品中所有重金屬元素之和，無法單獨定量特定元素的量；（3）在一些地區和國家，硫代乙酰胺因安全和環保原因被禁止使用，以致常規法受限。在這種背景下，ICH Q3D、USP35<232>提出了金屬雜質的指導原則。元素雜質包括可能會存在于原料藥、輔料或制劑中的催化劑和環境污染物，在檢測方面，處理傳統的原子吸收分光光度法外，一些新的檢測手段應運而生，如ICP-OES、ICP-MS可以同時定量測定多種金屬元素的含量。這些方法各具特色，比對情況及被《中國藥典》2010年版的收錄評價。
在質量標準設定上，首先應根據藥品生產中起始物料、原料、輔料或試劑中存在的，或在生產過 程中可能引入的元素種類及其允許日攝入量，來設定藥品中需要被檢測的元素。其次，應對含元素雜質的藥物的不同給藥途徑區別對待。
USP232對制劑中的元素雜質的控制限度。
制劑樣品中每一元素的量應不超過日劑量允許日暴露量。構成制劑的原料和輔料中每個元素加和的結果應不超過日劑量允許最大暴露值。
化學藥物金屬雜質限度應用舉例如下：
（1）500 mg片劑，每天服用一次，檢測得片劑中砷為0.75 μg/g，通過公式計算0.75 μg/g×0.5 g/d×1＝0.375 μg/d＜1.5 μg/d（口服制劑砷的PDE），結果符合規定；
（2）0.250 g片劑，每天服用兩次，1片/次，配方組成及含鉛量分別為0.05 g API含有2.0 μg/g鉛，0.1 g 輔料1含有1.0 μg/g鉛，0.1 g輔料2含有10.0 μg/g鉛，按公式計算，每片含鉛＝（0.05 g×2.0 μg/g）＋（0.1 g×1.0 μg/g）＋（0.1 g×10.0 μg/g）＝1.2 μg Pb/片；2片/d＝2.4 μg Pb/d（口服每天限度為5 μg Pb/d，片劑符合要求。
上述給定的安全性數據或限度會隨著新的數據使用而更新。在藥物的金屬雜質分析中，ICH Q3D把金屬元素分為4類：Ⅰ類元素具有明顯的毒性，如砷、鎘、汞、鉛，各種給藥途徑的藥物均需考察。Ⅱ類元素雜質的毒性與制劑的給藥途徑有關，又細分為ⅡA和ⅡB類。ⅡA類具有較高的自然豐度，需要對所有潛在來源和給藥途徑進行評價，這類元素包括釩、鉬、硒、鈷；ⅡB類如金、鉈、鈀、鉑、銀、銥、銠等，當這些元素刻意添加或使用到原料生產過程中時才需要評價其潛在來源；Ⅲ類元素如銻、鋇、鋰、鉻、銅、錫、鎳等，對于口服給藥的制劑，除非該元素作為原料的一部分而刻意加入，否則無需進行安全性評級。對于注射劑和吸入制劑，任何可能引入該類元素的可能性均需進行風險評估。Ⅳ類元素如鋁、硼、鐵、鋅、鉀、鈉、鈣、鎂等，由于其低毒性或尚未建立PDE標準，一般無需風險評估。該指南建議采用“鑒別（識別）→分析→評估→控制”4步法的思路。鑒別已知的元素雜質，找出其引入藥品的潛在源頭；分析確定特定元素在藥物中存在的可能性；以PDE標準比較實測值與預測值的差距；最后建立并實施控制手段限度藥品中的雜質。
需要特別說明的，砷和汞作為兩種特殊的元素均含有兩種雜質形態：有機型和復合無機型，導致毒性差異較大，無機砷大多有毒；汞限度是基于無機二價氧化態，甲基汞形式毒性最強；因此，作為中藥使用的朱砂和雄黃，要注意元素形態的分析。
本文也匯總了一些特定情形的金屬殘留限度：
（1）中藥注射液[53]，按各品種最大日劑量計算，含鉛、鎘、砷、汞、銅分別不得超過12、3、6、2、150 μg。
（2）藥用植物及制劑進出口綠色行業標準[54]規定：重金屬總量不得超過20.0 mg/kg，鉛、鎘、汞、銅、砷分別不得超過5.0、0.3、0.2、20.0、2.0 mg/kg。
（3）對于與藥品直接接觸的包裝材料和容器根據需要也控制金屬元素，如低密度聚乙烯輸液瓶的質量標準（YBB00012002）中，為了控制聚乙烯聚合中催化劑及生產管道等設備中混入金屬元素，特對有毒有害的金屬進行針對性檢測：在“金屬元素”一項要求含銅、鎘、鉻、鉛、錫、鋇均不得超過3×10−6；在“溶出物試驗”中，要求鋇、銅、鉛、鎘不得過1×10−6 ，鎘、錫不得過1×10−7，鋁不得過5×10−8 。
2.4 5-羥甲基糠醛
5-羥甲基糠醛（5-HMF）為葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水而成，葡萄糖注射液其USP標準和中國藥典標準分別控制不超過0.09%、0.02%。果糖注射液，英國藥典標準和中國藥典標準分別控制不超過0.19%、0.12%，可見我國標準更為嚴謹[55]。
2.5 二氧化硫
中藥材經硫磺熏蒸能殺滅藥材中的成蟲及蟲卵，抑制霉菌生長，使藥材及其飲片外形上美觀，容易上市銷售。但因硫磺燃燒產生的二氧化硫與藥材中的水分和無機鹽結合，形成亞硫酸鹽，被人體服用后與人體蛋白中的巰基進行結合反應，刺激消化道黏膜，出現惡心、嘔吐、腹瀉等中毒癥狀，長期服用，還可在人體內轉化成強致癌物亞硝胺。
《中國藥典》版在附錄中增加了二氧化硫殘留量測定法，但對具體中藥飲片品種的殘留限度未作出相應規定。國家食品藥品監督管理局組織制訂了中藥材及其飲片二氧化硫殘留的限量標準，并由國家藥典委員會自2011年6月10日起面向社會公開征求意見。規定山藥、牛膝、粉葛、甘遂、天麻、天冬、天花粉、白及、白芍、白術、黨參11種傳統習用硫黃熏蒸的中藥材及其飲片，二氧化硫殘留量不得超過400 mg/kg；其他中藥材及其飲片的二氧化硫殘留量不得超過150 mg/kg。FAO/WHO制定的食品添加劑通用標準（第33屆CAC大會2010年更新）規定：草藥及香料中亞硫酸鹽殘留量“以二氧化硫計不得超過150 mg/kg；韓國食品醫藥品安全廳第2008-3號公告中要求，進入韓國市場銷售的金銀花、當歸等總計266中藥品種采用Monier-Williams改良法檢測，限量標準要求低于30 mg/kg。而目前中國藥典委員會推薦的11種藥材的二氧化硫殘留限度400 mg/kg及其他品種二氧化硫殘留限度150 mg/kg，限度范圍相對較大[56]。
在二氧化硫殘留量計算的問題上，有學者研究了扣除水分按干燥品計算的方法，多批藥材的平均水分量為11.3%，扣除水分后，二氧化硫的量平均增高11.3%，該結果更加合理客觀。
因此，如何科學合理地規定二氧化硫限度還需進一步研究。
2.6 農藥
《中國藥典》規定了甘草、黃芪、人參莖葉總皂苷、人參總皂苷中有機氯類農藥的殘留限度；《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》規定六六六不得超過0.1 mg/kg，DDT不得超過0.1 mg/kg，五氯硝基苯不得超過0.1 mg/kg，艾氏劑不得超過0.02 mg/kg[58]。與《歐洲藥典》、《美國藥典》相比，《中國藥典》收載的農藥檢查項的品種相對較少，因此，業內專家強調，中國市場上的上百種農藥產品，藥典規定的農藥檢測品種太少，標準也相當陳舊，國家明令禁止使用的農藥應該被藥典收錄。
在制定農藥最大允許殘留量（MRL）時，需要兼顧產品特點和分析方法靈敏度的要求。MRL是由國際食品法典委員會或各國政府設定的允許某一農藥在某農產品、食品或飼料中的最高法定允許濃度。制訂程序如下：首先，根據農藥的毒理學數據，評估其毒性并設定每日允許攝入量；然后，確定優良農業措施，研究農藥在植物體內的殘留和代謝，以及根據殘留試驗結果進行MRL值的推薦；最后，進行風險評估，作出同意、不同意或修改推薦MRL值的決定。
2.7 中藥中的真菌毒素
真菌毒素是由真菌產生的具有毒性的二級代謝產物，主要包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等，可廣泛污染農作物、植物及其副產品等。黃曲霉毒素是一種毒性極強的劇毒物質，目前少數國家和地區對中藥材制定了黃曲霉素和赭曲霉素A的限量標準。《中國藥典》版一部及其增補本收載了桃仁、僵蠶、酸棗仁等藥材黃曲霉毒素的殘留限量檢測（分析均采用柱后碘衍生化，熒光檢測器），規定藥材中黃曲霉毒素B1的量不得過5 μg/kg，黃曲霉素（B1＋B2＋G1＋G2）含量不得過10 μg/kg。歐盟規定肉豆蔻、干姜、姜黃中的赭曲霉素A的限量為15 μg/kg，甘草根的提取物中赭曲霉素A的限量為20 μg/kg。
中藥真菌毒素限量標準的制定首先基于毒理學的研究成果，在人體每日最大允許攝入量的基礎上，結合用法用量以及疾病治療中的暴露評估和危險評估，最終確定最高殘留限度。
3、結語
藥物的雜質研究伴隨著研發設計、過程控制、放行檢驗、毒理學觀察等環節，搞清楚雜質的來龍去脈是研究控制手段的前提，在制定質量標準的雜質限度時，要充分考慮雜質的量與安全性，同時關注生產工藝的科學性和經濟性，統計數批產品的放行數據和穩定性研究報告，綜合各因素制定雜質的可接受限度。近年來，隨著新的分析檢測技術的問世和推廣，藥物中微量的有害物質正逐漸被闡明揭示其化學結構或物質基礎，在雜質的安全性研究上也涌現了一些快速篩選平臺，為今后產品的質量控制奠定了基礎。
來源：北京藥研匯
