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做DNA提取及含量測定是，你是否一次成功，有沒有遇到過奇怪的問題，一起來看看前輩的經驗總結，跟小析姐一起get技能，無懼實驗！

DNA提取

制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟,通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為后續的實驗打下基礎。主要是CTAB方法,其他的方法有:1、物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2、化學方式:異硫氰酸胍法,堿裂解法3、生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有:硅質材料、陰離子交換樹脂等。下面介紹一下本實驗室常用的幾種方法。

(一)經典DNA提取方法——酚氯提取法:

試驗原理: 

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑,反復抽提,使蛋白質變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子,核蛋白變性降解,使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水,不溶于有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團,也容易進行水合作用,并在表面形成一層水化層,使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時,蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞,變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相),DNA存在于上層水相中,蛋白質則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質。氯仿的作用是有助于水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽,真空干燥,用TE緩沖液溶解DNA備用。

具體步驟:

取枸櫞酸鈉抗凝外周血2ml加8ml 1×紅細胞裂解液放在15ml離心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm離心10min,去除上清。加1×紅細胞裂解液4ml,充分混勻, ,3000rpm離心10min,去除上清,加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k搖勻, 37℃搖床過夜(>8h)。加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,溫和充分混勻,靜置10分鐘, 離心3000rpm×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中,加等體積飽和酚,混勻,離心3000rpm×10min,取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿(1:1),輕輕混勻,離心3000rpm×10min,取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重復此步驟數次。加等體積氯仿,輕輕混勻,離心3000rpm×10min 。取上層水相到另一管中, 加2倍體積的無水乙醇及少量生理鹽水,輕輕倒置混勻。待絮狀物出現后,離心12000rpm×10min,棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌,離心12000rpm×10min ,棄上清液。室溫下揮發乙醇,待沉淀將近透明后加TE水溶解過夜。Nanodrop 核酸定量分析儀測定DNA濃度并記錄,最后將所提DNA放置-20℃凍存。

(二)真核細胞DNA的制備:

一般真核細胞基因組DNA有107-109bp,可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞,隨后用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切后可用于Southern分析,還可用于PCR的模板、文庫構建等實驗。

根據材料來源不同,采取不同的材料處理方法,而后的DNA提取方法大體類似,但都應考慮以下兩個原則: 

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。

具體步驟:

（1）試劑準備:TE: 10mM Tris-HCl(pH7.8),1mM EDTA (pH8.0),TBS: 25mM Tris-HCl(pH7.4),200mMNaCl;5mMKCl,裂解緩沖液(250mMSDS,使用前加入蛋白酶K至100mg/ml),20%SDS,2mg/ml蛋白酶K,Tris飽和酚(pH8.0),酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1),無水乙醇,75%乙醇。

（2）新鮮或冰凍組織處理:取組織塊0.3-0.5cm3(大約100g) 剪碎,加TE 0.5ml,轉移到勻漿器中勻漿。將勻漿液轉移到1.5ml離心管中。加20%SDS 25ml,蛋白酶K (2mg/ml)25ml,混勻。60°C水浴1-3小時(根據樣本的情況可適當增加水浴時間)。

（3）提取DNA: 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,充分混勻3min。離心5000g×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中。加等體積飽和酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重復此步驟數次。加等體積氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。加1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇,輕輕倒置混勻。待絮狀物出現后,離心5000g×5min,棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌,離心5000g×3min,棄上清液。室溫下揮發乙醇,待沉淀將近透明后加50-100ulTE溶解過夜。

(三)DNA提取試劑盒制備DNA模板

DNA提取試劑盒是適用于PCR研究的快速提取DNA的方法,與經典酚氯提取法相比,高效、快速的提取純度較高的DNA,操作過程簡單,無毒無味,所需樣品材料的量較少;但價格較為昂貴,且產出DNA的量少。現今全血DNA提取試劑盒、細胞及組織DNA提取試劑盒等均已商品化,可在TIANGEN, 寶生物、QIAGEN等生物公司購買,其具體實驗步驟參照試劑盒中提供的說明書操作,下面以唾液中DNA的制備為例,介紹DNA提取試劑盒(QIAamp Blood DNA Mini Kit)的使用步驟。

具體步驟:

1、0.5 mL唾液以1 mL PBS緩沖液(pH 7.4)重懸,3000g離心5分鐘,棄上清;

2、沉淀以200ml PBS緩沖液和20ml Protease重懸后,按QIAamp DNA Kit試劑盒使用要求制備DNA(洗脫體積50ml):加入200mL 裂解液AL,渦懸混合器處理15秒, 56℃ 水浴10min,離心機上甩一下, 加入200mL 無水乙醇,混勻, 轉入spin cloumn中, 6000g離心 1min, 棄濾出液,柱子中加入500ml AW1, 6000g 離心1min, 棄濾出液,加入500ml AW2, 20000g 離心3min, 棄濾出液, 將柱子中溶液置于新1.5ml EP管中,加入50ul AE,室溫或56℃靜置1-3min, 再次6000g 離心1min 收獲DNA。

DNA含量及純度的檢測

實驗原理:

一種方法是通過凝膠電泳的方法檢測DNA的含量:取2-5μlDNA溶解液與0. 4μl 6×載樣緩沖液混合,用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)檢測。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結構中,嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發而發出熒光,這種熒光強度與DNA總質量數成正比,通過比較樣品與標準品的熒光強度,對樣品中的DNA進行定量。(詳見凝膠電泳)

另一方法是分光光度法,組成DNA的堿基,具有一定的吸收紫外線的特性,其最大吸收值在波長250-270nm之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后,其吸收紫外線的特性沒有改變,核酸的最大吸收波長為260nm,利用DNA的這個物理特性來測定DNA的濃度。同時可以檢測280nm處紫外吸收值,當OD260/OD280的值在1.8-2.0之間時DNA純度較好,排除蛋白等的污染,可用于PCR等DNA質量要求較高的實驗。

分光光度法的具體方法是

1、取兩只清潔的比色杯,各加入2ml 0.1mol/L TE校正零點。

2、以其中的一只比色杯作為空白對照,在另一只比色杯中加入4μlDNA溶液,再加入0.1mol/L TE至2ml混勻(V/V=1:8)。

3、測定波長為260nm時的OD值,再將波長調至280nm測其OD值。

4、根據OD260=1時,雙鏈的DNA濃度為50μg/ml,單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml,按計算公式:樣品DNA濃度(μg/ml)=OD260×40μg/ml×稀釋倍數,計算樣品的DNA濃度。

現今實驗室使用nanodrop核酸定量分析儀檢測DNA的含量和純度,僅需 2μl DNA溶液便可檢測出所需數據,并有紫外吸收圖譜。

DNA提取的注意事項

1、裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡,使用平衡飽和酚。苯酚具有高度腐蝕性,飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷,因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發,具有神經毒作用,操作時應注意防護。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作,以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA,不能攪動基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時,要用專用的粗口吸頭,普通吸頭可能會切斷DNA或造成DNA缺口。

12、在準備實驗的過程中,應將DNA樣品放在碎冰上。

13、加緩沖液后,為了加速DNA溶解,可以輕輕晃動或輕彈試管。

14、加入緩沖液后,置于4度過夜,也可以溶解DNA。

15、將DNA溶液65度溫育10分鐘,可以滅活DNase。

16、在抽提過程中如果水相和有機層的界面不太清楚,說明其中蛋白質含量較高,可增加酚/氯仿抽提的次數或適當延長離心的時間。

17、酚抽提時如果上清液太粘稠,無法進行水相轉移時,可加入適量TES稀釋后再抽提。