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隨著毒理學(xué)學(xué)科的延伸與發(fā)展，越來(lái)越多的研究工具和評(píng)估方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，以替代傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)，一方面能更好地保障動(dòng)物福利，另一方面也可以實(shí)現(xiàn)更高通量的評(píng)估效率。

這些替代方法包括了化學(xué)測(cè)試（in chemico）、體外測(cè)試（in vitro）和計(jì)算機(jī)模擬（in silico），并可應(yīng)用于皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等毒性節(jié)點(diǎn)方面。

但是在不少替代方法的實(shí)際使用過(guò)程中，受限于單個(gè)方法本身的局限性，通常需要采用多組替代方法并結(jié)合專家評(píng)價(jià)的方式得出最終的結(jié)論以用于法規(guī)需求。

為了提高替代方法在化學(xué)品法規(guī)應(yīng)用方面的適用性與規(guī)范性，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）于2021年7月首次發(fā)布了一類(lèi)限定方法（Defined Approach, DA）來(lái)用于評(píng)價(jià)化學(xué)品的皮膚致敏性。

該方法被采納為OECD TG 497，主要基于皮膚致敏的有害結(jié)局（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架，通過(guò)限定的幾組替代方法采用規(guī)范化流程來(lái)完成對(duì)目標(biāo)化合物評(píng)估致敏性的評(píng)價(jià)。

有害結(jié)局路徑與皮膚致敏作用機(jī)制

有害結(jié)局路徑 AOP 最核心的內(nèi)容在于規(guī)范化和模塊化了從分子、細(xì)胞、組織、器官及至最終個(gè)體與群體水平的一系列毒性發(fā)生事件，并強(qiáng)調(diào)以邏輯推理性來(lái)確定這些毒性發(fā)生事件的前后關(guān)系。

在AOP框架中，毒性事件可以具體分為分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE; 在OECD指南中也被定義為Key Event 1， KE1），關(guān)鍵事件（Key Events, KEs）和有害結(jié)局（Adverse Outcome, AO）這三大類(lèi)，而各個(gè)過(guò)程則是通過(guò)關(guān)鍵事件關(guān)系（Key Event Relationships, KERs）進(jìn)行連接。

簡(jiǎn)單地來(lái)說(shuō)，皮膚致敏事件可以理解為由一個(gè)分子起始事件開(kāi)始，從而導(dǎo)致多個(gè)關(guān)鍵事件的發(fā)生，最后終結(jié)于“過(guò)敏性接觸性皮炎”這一有害效應(yīng)的過(guò)程。

皮膚致敏限定方法的開(kāi)發(fā)即是建立于皮膚致敏的AOP框架之中（AOP ID: 40; OECD Project: 1.1），皮膚致敏過(guò)程分為誘導(dǎo)階段和隨后的免疫反應(yīng)激發(fā)階段。

第一個(gè)階段主要的分子起始事件（MIE, 即KE1）為外源物質(zhì)與皮膚蛋白的共價(jià)結(jié)合，形成半抗原。

隨后觸發(fā)了兩個(gè)細(xì)胞水平的關(guān)鍵事件（KEs），其中KE2為角質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)；KE3則是樹(shù)突狀細(xì)胞的激活。

第三個(gè)關(guān)鍵事件（KE4）則發(fā)生在器官水平，其過(guò)程為KE3中經(jīng)活化的樹(shù)突狀細(xì)胞遷移至局部淋巴結(jié)，并向初始型T細(xì)胞遞呈組織相容性復(fù)合物（MHC），從而導(dǎo)致記憶T細(xì)胞的增殖與分化。

而一旦此個(gè)體的皮膚再次接觸原外源化合物時(shí)，則會(huì)進(jìn)入免疫反應(yīng)激發(fā)階段，最終造成有害結(jié)局（AO）：過(guò)敏性接觸性皮炎的發(fā)生。

皮膚致敏的AOP框架

皮膚致敏過(guò)程的誘導(dǎo)階段

皮膚致敏過(guò)程的激發(fā)階段

與關(guān)鍵事件相關(guān)的皮膚致敏試驗(yàn)方法

基于已建立的皮膚致敏的AOP框架，截止到目前針對(duì)于KEs已經(jīng)有開(kāi)發(fā)了一系列測(cè)試方法，且部分已被OECD測(cè)試指南收錄為標(biāo)準(zhǔn)方法。針對(duì)這部分被OECD測(cè)試指南收錄的方法總結(jié)如下：

限定方法與整合測(cè)試和評(píng)估方法

雖然基于皮膚致敏AOP框架已開(kāi)發(fā)了上述一系列的體外測(cè)試方法，但由于皮膚致敏反應(yīng)機(jī)制涉及多因素、多水平的復(fù)雜分子生物學(xué)過(guò)程，因此單一的體外測(cè)試方法并不能保障對(duì)目標(biāo)化合物的皮膚致敏性有足夠的預(yù)測(cè)能力。

基于這一原因，皮膚致敏整合測(cè)試和評(píng)估方法（IATA）應(yīng)運(yùn)而生。

具體而言，IATA運(yùn)用了多組體外測(cè)試結(jié)果并結(jié)合了專家評(píng)價(jià)來(lái)綜合判斷目標(biāo)化合物是否具有皮膚致敏性，但顯而易見(jiàn)的是這種方式并不能完全適用于法規(guī)需求中的決策目的，最主要的影響條件在于不同專家評(píng)價(jià)結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致開(kāi)放性的結(jié)論，造成無(wú)法對(duì)目標(biāo)化合物的皮膚致敏性評(píng)估達(dá)成統(tǒng)一性判斷。

為了讓替代方法更能夠滿足法規(guī)需要，逐漸發(fā)展而來(lái)的限定方法（Defined Approach, DA）與IATA最大的差異在于不再依賴專家評(píng)價(jià)，僅采用限定的幾組體外試驗(yàn)結(jié)果，即可對(duì)目標(biāo)化合物完成致敏性評(píng)估。

除此之外，通過(guò)按規(guī)定流程結(jié)合(Q)SAR預(yù)測(cè)的方式，DA也能夠進(jìn)一步得出法規(guī)所需的統(tǒng)一危害分類(lèi)結(jié)果。

皮膚致敏限定方法OECD TG 497的評(píng)估流程

在OECD TG 497中，皮膚致敏性的限定方法主要有如下3種：

01

從一組in chemico 試驗(yàn)（KE1, OECD TG 442C: DPRA）和兩組

in vitro 試驗(yàn)（KE2, OECD TG 442D: KeratinoSensTM ; KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）中采用“3選2（2o31）”的限定方法對(duì)目標(biāo)化合物的皮膚致敏性進(jìn)行危害識(shí)別。

02

通過(guò)采用一組in chemico試驗(yàn)（KE1, OECD TG 442C: DPRA）、一組in vitro試驗(yàn)（KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）與一組in silico方法（Derek Nexus）的結(jié)果形成整合測(cè)試策略（ITSv12），基于EG DASS3專家組發(fā)展而來(lái)的數(shù)據(jù)解釋步驟（DIP4）來(lái)對(duì)目標(biāo)化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類(lèi)結(jié)論。

03

通過(guò)采用一組in chemico試驗(yàn)（KE1, OECD TG 442C: DPRA）、一組in vitro試驗(yàn)（KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）與一組in silico方法（OECD QSAR Toolbox）的結(jié)果形成整合測(cè)試策略（ITSv22），基于EG DASS3專家組發(fā)展而來(lái)的數(shù)據(jù)解釋步驟（DIP4）來(lái)對(duì)目標(biāo)化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類(lèi)結(jié)論。

1 2o3: 3選2（2 out of 3）

2 ITSv1或ITSv2: 整合測(cè)試策略v1或v2（integrated testing strategy version 1 or version 2）

3 EG DASS: 皮膚致敏限定方法開(kāi)發(fā)專家組（Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation）

4 DIP: 數(shù)據(jù)解釋步驟

（Data interpretation procedure）

2o3皮膚致敏限定方法的決策樹(shù)

ITSv1/ITSv2皮膚致敏限定方法的決策樹(shù)

皮膚致敏限定方法的性能評(píng)估

雖然受限于數(shù)據(jù)集的大小，但在OECD TG 497中也盡可能地評(píng)估了三種限定方法對(duì)皮膚致敏的預(yù)測(cè)性能（如下圖所示）。

可以發(fā)現(xiàn)的是當(dāng)前這三種限定方法已在準(zhǔn)確度（Balanced Accuracy, BA）、靈敏度（Sensitivity, Sens）和特異性（Specificity, Spec）方面均基本能滿足法規(guī)需求，且與IATA相比也不再需要額外的專家評(píng)價(jià)，因此該限定方法的開(kāi)發(fā)極大提升了替代方法應(yīng)用于皮膚致敏評(píng)估時(shí)的適用性與規(guī)范性。

但仍需要注意的是這些限定方法仍受限于具體的替代方法本身（如DPRA, KeratinoSensTM和h-CLAT對(duì)于Log P > 3.5的目標(biāo)化合物預(yù)測(cè)靈敏度較低；金屬化合物不適用于DPRA試驗(yàn)等），以及當(dāng)出現(xiàn)不明確的結(jié)論時(shí)還需要進(jìn)一步的分析策略。

三種限定方法與LLNA方法在預(yù)測(cè)OECD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)致敏性的表現(xiàn)