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嘉峪檢測網 2021-12-24 21:02
摘要 目的:鮮竹瀝的法定工藝為干餾法和燒制法,而依據水提取法制備的鮮竹提取液多冒用為鮮竹瀝流通市面,鮮竹瀝現行的質量標準難以將二者進行區分。本研究嘗試建立糖-固比的分析方法,探討其在鑒別鮮竹瀝及鮮竹提取液的應用。方法:共收集37批鮮竹瀝（含干餾法20批,燒制法17批）和15批鮮竹提取液,將樣品稀釋,以硫酸-苯酚直接顯色,或乙酸乙酯萃取后顯色,于490 nm測定吸光度。參照衛生部藥品標準中藥材第一冊“鮮竹瀝”項測定總固體,計算總糖、總固體及其占比（糖-固比）。結果:干餾法鮮竹瀝總糖含量為0.38~5.36 mg·mL-1,總固體0.70~13.01 mg·mL-1,糖-固比34.0%~62.2%;燒制法樣品總糖含量為0.77~15.95 mg·mL-1,總固體2.34~27.97 mg·mL-1,糖-固比33.1%~69.0%;鮮竹提取液總糖含量為6.46~14.69 mg·mL-1,總固體為11.76~20.40 mg·mL-1,糖-固比38.7%~82.7%。鮮竹瀝（干餾、燒制法）樣品糖-固占比與鮮竹提取液差異顯著（P<0.05）。結論: 本研究證明總糖測定法可用于鮮竹瀝質量評價。研究首次采用糖-固占比有效甄別法定工藝（燒制、干餾法）鮮竹瀝和非法定工藝（水提取法）制備的鮮竹提取液,表明糖類是鑒別鮮竹瀝的潛在標志物。上述結果可為鮮竹瀝炮制工藝規范和質量標準的提升提供物質基礎和技術支撐。
關鍵詞:鮮竹瀝;鮮竹提取液;硫酸-苯酚法;總糖;總固體;糖-固比
Abstract Objective: The authorized methods for the preparation of Xianzhuli (XZL) is considered to be retorting and baking methods. However, the bamboo water extract (BWE) prepared by water extraction is mostly counter feited as XZL since it is difficult to distinguish both products (BWE and XZL) under current quality standard of XZL.This study attempts to establish an analytical method by using sugar-solid rate (SSR) and explore its application in the discrimination between BWE and XZL. Methods: 37 batches of XZL (including 20 batches of retorted XZL and 17 batches of bakedones) and 15 bathes of BWE were collected. All the samples was diluted with water, colored directly with sulfuric acid-phenol reagent or colored after extracted with ethyl acetate. The absorbance was measured at a wavelength of 490 nm. The total solid was determined as per drug standard of ministry of health Chinese Herbal Medicine Volume 1. The ratio of total saccharides to total solid was calculated. Results: The contents of total saccharides and total solids of XZL by retorting method were 0.38-5.36 mg·mL-1and 0.70-13.01 mg·mL-1 respectively, and the SSR were 34.0%-62.2%.The contents of total saccharides and total solids of XZL by baking method were 0.77-15.95 mg·mL-1 and 2.34-27.97 mg·mL-1 respectively,and the SSR were 33.1%-69.0%. The contents of total saccharides and total solids of BWE were 6.46-14.69 mg·mL-1 and 11.76-20.40 mg·mL-1 respectively, and the SSR were 38.7%-82.7%. The SSR of XZL by retorting and baking methods had the significant difference from that of BWE (P<0.05).Conclusion: Our investigation suggested that the UV based quantitative method for assay of total saccharides could be used in the quality control of XZL. To the best of our knowledge, this is the first paper on the application of RSS in differentiating effectively between XZL by authorized methods (retorting and baking methods) and BWE. Also,these data suggested that saccharides could be served as a potential marker for the identification of XZL, paving chemical evidence and technical support for the specification of processing method and upgradation of quality control of Xianzhuli.
Key words: Xianzhuli; bamboo water extract; sulfuricacid-phenol; total saccharides; total solids; sugar-solid rate
鮮竹瀝（Xianzhuli）是禾本科植物粉綠竹Phyllostachys glauca、凈竹P. nuda及同屬的數種植物的鮮桿經加熱后自然瀝出的液體[1],宋代《本草衍義》稱其為“痰家之圣劑”,治療肺熱咳嗽痰多、小兒痰熱驚風等癥狀。臨床上多用于治療由各種肺部病變及呼吸道感染引發的咳嗽,對咽炎、呼吸道感染、支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、中風引發的肺部病變均有顯著的治療效果[2]。鮮竹瀝的臨床療效與其炮制工藝密切相關。鮮竹瀝的古法制備工藝有燒制法（baking method, BM）和干餾法（retorting method, RM）。燒制法始載于唐代《備急千金要方》,主要將竹子與熱源（火）直接接觸獲取竹瀝:“取淡竹斷兩頭節,火燒中央,器盛兩頭得汁”。明代《本草綱目》收錄了干餾法,該法將竹子盛放于容器內,與熱源（火）間接接觸制備竹瀝:“以住截長五六寸,以瓶盛,倒懸,下用一器承之,周圍以炭火逼之,其油瀝于器也”[3-4]。兩種制法在各地中藥飲片炮制規范中均有收錄,是鮮竹瀝的法定制備工藝[5-6]。實地調研發現市面多以水提取法制備的鮮竹提取液（bamboo water extract,BWE）冒用作鮮竹瀝。該品種收錄于《湖南省中藥材標準》（2009年版）[7],而水提取法未收錄于鮮竹瀝相關標準,屬于非法定工藝。鮮竹瀝產品現行質量標準收載于《衛生部藥品標準中藥材》（第一冊）[1],目前鮮竹瀝標準項目僅性狀、pH值、總固體、相對密度及薄層鑒別項[3-6],無法區分鮮竹瀝與鮮竹提取液,其質量標準亟待提升。目前從鮮竹瀝中發現了糖[8]、核苷[9]、木脂素[10]、酚[11]、黃酮、氨基酸[12]及寡肽[13]等類成分。其中,糖類是鮮竹瀝的主要成分[14],已經鑒定出D-果糖、D-葡萄糖及蔗糖[4]。本研究在測定52批鮮竹瀝（干餾法、燒制法制備）與鮮竹提取液（水提取法制備）樣品總糖含量及總固體的基礎上,計算樣品的總糖總固體占比（糖-固比,sugar-solid rate）,以此指標評價鮮竹瀝與鮮竹提取液對糖的影響,為鮮竹瀝炮制工藝規范和質量標準的提升提供技術支撐。
1 儀器與試藥
島津紫外分光光度計UV-2600,Sartorius BT 25S型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。37批鮮竹瀝（包括20批干餾法、17批燒制法）樣品均由江西仁安藥業有限公司生產,15批鮮竹提取液按照《湖南省中藥材標準》（2009年版）“鮮竹提取液”項下制備,所有樣品均由禾本科剛竹屬（Phyllostachys）毛竹（P. heterocycla (Carr.) Mitford cv. Pubescens）制備;D-無水葡萄糖對照品（批號:110833-201707,ID:JGNY-QGLJ,純度:99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院;水為超純水,其余試劑均為分析純。
2 方法和結果
2.1 溶液制備
2.1.1 葡萄糖對照品溶液
稱取105 ℃下干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品適量,精密稱定,用水溶解并稀釋成每1 mL含100 μg的對照品液①和每1 mL含45 μg的對照品液②。
2.1.2 供試品溶液
精密吸取燒制法鮮竹瀝、鮮竹提取液各2.0 mL,分別置20.0 mL容量瓶中,以水稀釋至刻線,搖勻;精密吸取上述溶液1.0 mL,置不同體積容量瓶（2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mL）中,以水稀釋至刻度線,搖勻,即得燒制法鮮竹瀝、鮮竹提取液供試液。精密吸取干餾法鮮竹瀝液2.0 mL,置20.0 mL量瓶中,以水稀釋至刻度線,搖勻,以20.0 mL乙酸乙酯萃取4次,收集水層,或精密吸取水層1.0 mL,置10.0 mL量瓶中,以水稀釋至刻度線,搖勻,即得干餾法鮮竹瀝供試液。
2.2 檢測波長確定
精密吸取燒制法鮮竹瀝供試液（批號:20201101）和對照品液②各2.0 mL,于10.0 mL具塞試管中,依次精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,渦旋混勻,靜置10 min后于40 ℃水浴中孵育30min,取出,冰浴至室溫,于200~700 nm范圍內掃描紫外吸收光譜。結果表明供試品和對照品溶液均在490 nm處有最大吸收,因此選擇490 nm作為檢測波長。
2.3 孵育時間考察
精密吸取2.0 mL對照品液②于10.0 mL具塞試管中,依次精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,渦旋混勻,靜置10 min后于40 ℃水浴中分別孵育0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 min,取出,冰浴至室溫,于490 nm下測定各時間點吸光度值。結果表明,隨著孵育時間延長,吸光度值先升高后降低,于30 min穩定,最終確定最佳孵育時間為30 min。
2.4 標準曲線繪制
精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的對照品液①于10.0 mL具塞試管中,加水補至2.0 mL,依次精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,渦旋混勻,靜置10 min后于40 ℃水浴孵育30min,取出,于冰浴中冷卻至室溫,以水為空白對照,于490 nm下測定各管吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(x),吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線,得線性回歸方程:y=0.0149x-0.029 6,r=0.999 7,線性范圍為10.01~70.08 μg·mL-1。
2.5 精密度試驗
精密吸取2.0 mL對照品液②,按照“2.4”項下方法連續測定6次,吸光度RSD%為0,表明儀器精密度良好。
2.6 穩定性試驗
精密吸取燒制法（批號:20201101）和干餾法（批號:2021030601）鮮竹瀝供試液各2.0 mL,按照“2.4”項方法分別于0、30、60、90、120、180 min測定吸光度。燒制法和干餾法供試液吸光度在0~180 min的RSD%分別為1.7%、4.1%,表明供試品在180 min內穩定。
2.7 重復性試驗
精密吸取燒制法（批號:20201101）和干餾法（批號:2021030601）鮮竹瀝供試液各2.0 mL × 6,按照“2.4”項方法測定吸光度,計算含量。燒制法和干餾法鮮竹瀝總糖含量的RSD%分別為1.1%、2.7%,表明方法重復性良好。
2.8 加樣回收率試驗
精密吸取已知含量的燒制法和干餾法鮮竹瀝供試液1.0 mL×6,分別精密加入適量濃度葡萄糖對照品液1.0 mL,按照“2.1.2”項方法制備溶液,按照“2.4”項方法測定吸光度,計算含量及回收率,平均回收率為101.3%~101.4%,RSD%為2.3%~3.0%,見表1。
3 樣品測定
取干餾法鮮竹瀝20批、燒制法17批、鮮竹提取液15批,按“2.1.2”項制備供試品溶液,按照“2.4”項方法測定總糖含量,見表2~4。由見表可知:干餾法鮮竹瀝總糖含量為0.38~5.36 mg·mL-1;燒制法總糖含量為0.77~15.95 mg·mL-1;鮮竹提取液樣品總糖含量為6.46~14.69 mg·mL-1。
4 總固體及糖-固比測定
參照《衛生部藥品標準中藥材》（1992年版）第一冊“鮮竹瀝”項[6],精密量取鮮竹瀝液 25 mL,置干燥至恒重的蒸發皿中,蒸干,在105 ℃干燥5 h,移至干燥器中,冷卻30 min,迅速稱定重量,計算總固體（mg·mL-1）及糖-固比。由表2~4可知:干餾組樣品總固體為0.70~13.01 mg·mL-1,糖-固占比為34.0%~62.2%;燒制組樣品總固體為2.34~27.97 mg·mL-1,糖-固占比為33.1%~69.0%;鮮竹提取液樣品總固體為11.76~20.40 mg·mL-1 ，糖-固占比為38.7%~82.7%。
表3 燒制法鮮竹瀝總糖、總固體及糖-固比測定結果（n=2）
Tab.3 The test results of total saccharides, totalsolids and sugar-solid rate of Xianzhuli by BM
5 數據分析
采用Excel對試驗數據進行分析,以單因素方差分析比較干餾、燒制組鮮竹瀝的糖-固比與鮮竹提取液的差異,由表2~4可知,鮮竹提取液的糖-固比與干餾（P=0.03）、燒制組（P=0.003）鮮竹瀝差異顯著。
6 討論與結論
6.1 測定方法
選擇硫酸-苯酚法的原理為糖類在濃硫酸作用下迅速脫水生成糠醛或糠醛類似物,繼而與苯酚縮合使溶液顯色,在一定范圍內溶液顏色與糖含量成正比。該法所用試劑價格低廉,且操作簡便,靈敏度高,測定時不受蛋白質的干擾,因此,本研究選取該法測定鮮竹瀝及鮮竹提取液總糖含量。值得注意的是,苯酚在空氣中容易氧化生成醌類物質,導致波長發生偏移或吸收值不穩定,因此,在本研究中,苯酚在臨用前應重蒸餾,且現配現用[14]。
6.2 供試品前處理
以HPLC-ELSD法[Shodex Asahipak NH2P-50E（4.6 mm×250 mm,5 μm）色譜柱;流動相為乙腈-水;蒸發光散射檢測器:氮氣量:1.5~2.5 mL·min-1;漂移管溫度:40~50 ℃;柱溫為30~40 ℃;流速:1.0 mL·min-1]對干餾法、燒制法鮮竹瀝及鮮竹提取液的糖類成分進行了分析,結果表明葡萄糖在三種樣品中均屬于峰面積最高的成分,因此,本研究選擇葡萄糖作為總糖測定的標準單位。干餾法樣品HPLC-ELSD直接測定所得總糖含量均高于總固體,表明干餾法樣品存在干擾成分。采用乙酸乙酯可將干擾成分萃出,進一步研究發現,萃取4次可將干擾成分完全去除;HPLC-ELSD分析發現,在乙酸部位中沒有檢出糖類,僅存在于乙酸乙酯萃取后的水液中。因此,干擾成分的去除方法定為用乙酸乙酯萃取4次。這類干擾成分可用于區分干餾法與鮮竹提取液,是干餾法樣品潛在的指標成分,需進一步對其結構進行表征。
6.3 鮮竹瀝及鮮竹提取液總糖
鮮竹瀝的法定工藝為燒制法和干餾法,水提取法不屬于法定工藝。在本研究中,燒制法與干餾法鮮竹瀝總糖含量分別為0.77~15.95 mg·mL-1、0.38~5.36 mg·mL-1,與文獻報道的結果（18.0~21.9 mg·mL-1）差異較大[3];此外,本研究中燒制法與干餾法總糖含量RSD%分別為72.3%、40.5%,均存在顯著的批間差異,這些問題可能與樣品選擇或生產工藝有關。但是如果引入糖-固比計算,則燒制法與干餾法總糖含量RSD%分別下降到21.5%、16.9%,說明以此指標可以顯著降低批間差異。據調研,目前國內鮮竹瀝生產企業的工藝不盡相同,市售鮮竹瀝多存在人為添加糖的行為,以總糖含量為指標不一定能正確解決“糖勾兌”的現象[4],引入糖-固比可能是解決這一問題的有效策略。本研究中鮮竹瀝及鮮竹提取液的糖-固占比33.1%~82.7%,表明糖類是兩者的主要成分,這與Gao[15]的結果一致。干餾、燒制鮮竹瀝和鮮竹提取液的糖-固占比平均值分別為47.6%、49.8%和59.3%（表2~4）,單因素方差分析結果表明,干餾、燒制鮮竹瀝與鮮竹提取液糖-固占比存在顯著差異（P<0.05）。這些結果表明采用糖-固占比可有效區分鮮竹瀝與鮮竹提取液,糖類是鑒別鮮竹瀝的潛在標志物。通過實地調研發現,市面上既流通著非法定工藝（水提法）制備的“鮮竹瀝”（鮮竹提取液）,也存在糖勾兌鮮竹瀝的行為,制定合理的糖-固占比限度可有助于控制上述“亂象”。據表3和表4糖-固占比結果,建議將鮮竹瀝的糖-固占比限度定為不超過50%。同時,本研究初步顯示鮮竹瀝中單糖含量比例（葡萄糖和果糖約1:1）與文獻報道的結果基本一致[4]。因此,需進一步探索“單糖比”甄別鮮竹瀝與鮮竹提取液、“糖勾兌鮮竹瀝”的可行性。
6.4 結論
綜上,本研究采用硫酸-苯酚法建立了鮮竹瀝總糖的測定方法,測定了52批鮮竹瀝和鮮竹提取液的總糖含量,表明總糖測定法可用于鮮竹瀝的質量控制。首次采用糖-固占比有效甄別依據法定工藝（干餾法及燒制法）制備鮮竹瀝與按照非法定工藝（水提取法）生產的鮮竹提取液,表明糖類是鑒別鮮竹瀝的潛在標志物。總之,這些結果為鮮竹瀝炮制工藝規范及質量標準提升提供物質基礎與技術支撐。
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陳承瑜1,2, 楊東生1,2, 謝靜1,4, 付輝政3, 洪挺3, 高進1,4, 周毅生4, 曹暉1**
(1. 暨南大學藥學院, 廣州 510632; 2. 粵澳中醫藥科技產業園開發有限公司, 廣東珠海 519000;
3. 江西省藥品檢驗檢測研究院, 國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室,
江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心, 南昌 330029;
4. 盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司, 廣東珠海 519000）
來源：《中國藥品標準》2021年
