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嘉峪檢測網 2022-10-18 08:47
本文主要介紹了北京艾克倫醫療科技有限公司研發的醫療器械“Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）”的臨床前研發實驗。
一、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產品主要組成成分
產品主要組成成分見下表：
二、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產品預期用途
本試劑盒用于體外定性檢測人外周血血漿中 Septin9、SDC2、BCAT1 基因的甲基化。
病人外周血中甲基化的 Septin9、SDC2、BCAT1 基因可以通過 DNA 的特異擴增而被檢測到。本試劑盒適用于臨床醫師建議做腸鏡檢測，但因病人依從性差或其它醫學原因無法做腸鏡檢測患者的輔助診斷，不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據，不能用于普通人群的腫瘤篩查。本產品僅作為原發性結直腸癌的輔助診斷供臨床醫師參考。
Septin9（胞裂蛋白 9）是高度保守的三磷酸鳥苷結合蛋白septin 家族成員之一，廣泛存在于人體細胞，具有重要的腫瘤抑制作用，其甲基化被證實與結直腸癌的發生密切相關。SDC2（多配體蛋白聚糖-2）在結腸間充質細胞中表達，參與細胞增殖、細胞遷移和細胞-基質相互作用，可以通過多種途徑抑制腫瘤形成。BCAT1（支鏈氨基酸轉移酶 1）為原癌基因 MYC 直接調控的下游靶基因之一，其表觀遺傳沉默可導致 Wnt 信號激活，誘導腫瘤發生。研究發現，結直腸癌患者血漿樣本中 Septin9、SDC2 及 BCAT1 三基因啟動子區域呈高度甲基化。甲基化可導致基因轉錄受到抑制，從而影響基因的正常表達，并使其抑癌功能喪失。
三、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產品包裝規格
30 人份/盒。
四、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的產品檢驗原理
提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉化未發生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應產生尿嘧啶磺酸鹽，發生甲基化的胞嘧啶則不會被亞硫酸鹽轉化。將亞硫酸鹽轉化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴增，PCR 反應中的引物、探針能區分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優先得到擴增，與甲基化 Septin9、SDC2、BCAT1 基因序列特異性結合的熒光素探針可以在 PCR 反應中專一地檢測出甲基化序列。內參對照 ACTB（β-actin）基因用于評估檢測中 DNA 量是否足夠。
五、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的主要原材料的選擇
本產品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應液、人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA。這些原料均是通過外購的方式獲得。
其中引物的序列均由艾克倫醫療自行設計，由合成公司經過合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應液由供應商化學合成獲得；人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA由供應商提取純化獲得。
艾克倫醫療對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。
六、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的企業參考品設置情況
本產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品，組成如下：
陽性參考品包括3種，由一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因不同甲基化比例樣本組成。
陰性參考品包括3種，其中兩種為不同DNA濃度下，Septin9、 SDC2、BCAT1均無甲基化的參考品，一種為三基因均甲基化但
甲基化比例低于檢測限的陰性參考品。
精密度參考品包括2種，為一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因均甲基化，但甲基化程度高低不同的精密度參考
品。
檢測限參考品包括1種，為一定DNA濃度下，Septin9、SDC2、BCAT1三基因甲基化略高于檢測限水平的參考品。
七、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的生產工藝及反應體系研究
艾克倫醫療對試劑盒反應體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR反應液的選擇、陰/陽性質控品配方的確定等；對PCR
過程中的退火溫度進行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時間的研 究 ； 對 該 產 品 三 種 適 用 機 型 宏 石 PCR 分 析 系 統
SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應程序及分析條件進行了研究。
通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。艾克倫醫療根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最
佳的生產工藝。
八、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的分析性能評估探究
本產品分析性能評估內容包括：準確性（陽性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測限、分析特異性的評估；核酸提取試劑的性能評估；三種適用的 PCR 儀機型（宏石 PCR 分析系統SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評估。
準確性研究分別使用三個批次的試劑盒對企業陰/陽性參考品及臨床樣本來源的結直腸癌陰/陽性樣本池在三種適用機型上進行檢測，檢測結果為陽性符合率 100%、陰性符合率 100%。 將三個基因的甲基化模板 DNA 混合成 DNA 不同濃度和不同甲基化水平的樣本，使用試劑盒在三種適用機型上對其進行檢測，準確性為 100%。將臨床結直腸癌樣本來源的 DNA，配制成不同甲基化比例的 Septin9、SDC2、BCAT1 單基因甲基化樣本，在三種適用機型上對試劑盒檢測的準確性進行研究，準確性為100%。
精密度的研究使用了兩種不同的樣本。第一種樣本是精密度參考品，使用三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進行檢測。第二種樣本是臨床樣本混合的陰性樣本池和陽性樣本池樣品，對三批試劑盒的批次內/間、日內/日間（20 天）、操作者間及不同實驗室間的精密度進行評價。研究結果顯示 Septin9、SDC2、BCAT1 和 ACTB 基因 Ct 值的變異系數均小于 10%。檢測限研究，以陰性血漿樣本為基質，對不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進行檢測，確定血漿樣本的檢測限，并在三種適用機型上進行驗證。結果表明在血漿 DNA 濃度為 0.02ng/µL 時，試劑盒檢測 P 值為陽性的檢測限為 0.2%三基因甲基化，0.5%的 Septin9 基因甲基化、2%的 SDC2基因甲基化和 0.5%的 BCAT1 基因甲基化。特異性研究的擴增產物SNP分析顯示人群中的SNP位點對檢測結果無影響。交叉反應研究顯示，檢測試劑對于發生腸轉移的其它原發癌癥（包括子宮內膜癌、宮頸癌）檢出率較低，特異性均超過 80%，說明產品僅適用于原發性結直腸癌的檢測。檢測其它癌癥包括胃癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌的特異性均超過 80%。檢測自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風濕性關節炎的特異性均超過 90%。檢測其它腸道良性疾病包括腸腺瘤、腸息肉和腸炎樣本的特異性超過 85%。在有其它基因（SHOX2 和/或 RASSF1A）甲基化的肺癌樣本中，檢測的特異性超過 90%。
干擾實驗顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA（150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對檢測結果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮痛藥等在最大使用劑量范圍內，不影響試劑盒對樣本檢測的 Ct 值及 P 值判定。
對與試劑盒配套使用的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號，北京艾克倫醫療科技有限公司）進行了性能評估，結果表明其與市場常用的核酸提取轉化試劑（Qiagen游離核酸提取和快速亞硫酸氫鹽轉化試劑盒）在 DNA 提取效率、重復性及抗干擾能力性能相當。試劑盒對于臨床樣本游離DNA 的提取效率為 85.16%，提取轉化均符合進一步 PCR 檢測的要求。采用精密度研究中相同樣本進行了配套使用的血漿樣本處理試劑的提取精密度研究，結果表明在核酸提取過程中DNA 提取量、P 值的變異系數小于 10%。
對該產品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統 SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進行了性能評估，結果顯示在三種適用機型上的陰/陽性符合率、檢測限、精密度均符合質量要求，可以作為該產品的適用機型。
九、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的陽性判斷值研究
艾克倫醫療采用三基因擬合 P 值公式法確定陽性判斷值。每個樣本進行 3 次 PCR 平行測試，計算 Septin9、SDC2、BCAT1 和ACTB 基因 3 個復孔平均 Ct 值，其中各個基因無擴增時，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時，樣本檢測結果有效。在確定樣本檢測結果有效的情況下，樣本 P 值≥1.2 則判斷樣本為陽性，樣本 P 值＜1.2 則判斷樣本為陰性。陽性判斷值研究入組（訓練集和驗證集）有效樣本數共計513 例樣本，包括正常樣本 237 例、結直腸癌病人樣本 146 例、其它干擾樣本（包括腸腺瘤、腸息肉、腸炎、胃癌、食管癌和肝癌）130 例。樣本數據進行多種方法統計分析，包括 1/3 次PCR 反應 Ct 值、2/3 次 PCR 反應 Ct 值、3/3 次 PCR 反應 Ct 值、3 次 PCR 反應平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測準確率最高。并使用測試集樣本再次驗證三基因擬合公式和其它陽性判斷值方法，測試集研究入組有效例數 350 例樣本，包括腸道正常樣本 119 例、結直腸癌病人樣本 106 例、其它干擾樣本（包括腸腺瘤、腸息肉、腸炎、胃癌、食管癌和肝癌）125 例進行驗證，結果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.67%，靈敏度為90.57%，總符合率為 93.43%。
十、Septin9/SDC2/BCAT1 基因甲基化檢測試劑盒（PCR- 熒光探針法）的穩定性研究
艾克倫醫療對該產品的穩定性的研究包括長期穩定性、使用穩定性（包括開瓶穩定性、凍融穩定性和熱穩定性）及樣本穩定
性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩定性）。長期穩定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲存后的第 0、3、6、9、12、13 個月進行檢測，結果顯示產品在生產后 13 個月的產品性能符合技術要求，試劑性能穩定。確定產品有效期可達 12 個月。
使用穩定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開瓶放置，分別于第 2 周、4 周和 6 周后，檢測其外觀、準確性、靈敏度、精密度等指標，穩定性結果 P 值及 CV 值均無顯著差異，無顯著變化趨勢，其產品的主要性能均符合技術要求。將三批次試劑盒在規定的儲存條件下，取出試劑盒反復凍融 6 次，檢測每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1 天、2 天、3 天后檢測產品性能，均符合技術要求。
艾克倫醫療對全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩定性進行了研究，研究結果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer®，6mL，國械注進 20152222083）采集全血，建議選用 2～8℃放置 4 小時以內的新鮮血樣分離血漿后用于檢測；使用康為游離DNA 采血管（康為世紀，5mL，蘇械注準 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內的血樣分離血漿后用于檢測；使用 Streck Cell free 采血管（DNA Cell-Free DNA BCT®BLOOD COLLECTION TUBE，貨號 218962）采集全血，建議選用室溫放置 6 天以內的血樣分離血漿后用于檢測。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內，在 2～8℃保存 12 小時以內進行檢測；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內，在 2~8℃保存 16 小時以內進行 PCR 檢測。血漿樣本和 BisDNA 樣本僅可凍融一次。
來源：嘉峪檢測網
