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近日，北京卓誠惠生生物科技股份有限公司研發的“曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）”獲批上市，下面嘉峪檢測網與您一起了解一下曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）在臨床前研發階段做了哪些實驗。

1、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的主要組成成分

產品主要組成成分見下表：

2、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的產品預期用途

本試劑盒用于體外定性檢測人痰液樣本中曲霉菌屬、新型隱球菌和耶氏肺孢子菌的核酸 DNA。

本試劑用于肺部曲霉菌屬、新型隱球菌和耶氏肺孢子菌真菌感染的輔助診斷，不能單獨作為確診的依據。

適用人群主要為免疫低下、免疫缺陷人群，其他人群應有肺部真菌感染相關指征。

真菌感染常見于免疫低下或缺陷人群，具有較高的發病率和死亡率，其臨床癥狀表現不具有特異性，易被細菌、病毒等感染掩蓋，臨床上致病菌包括曲霉菌屬、隱球菌、耶氏肺孢子菌等，檢測多重真菌可用于輔助臨床診斷。

本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀、體征、病史、其它實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

該產品檢測陽性不能確定標本中有活病原菌，檢測結果應 結合其他臨床診斷綜合判斷。

本產品對于曲霉菌屬的檢測不能確認具體菌種，如有必要臨床應考慮對于曲霉菌屬陽性結果進一步確認感染的菌種。 

3、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的檢驗原理

本試劑盒分別選取曲霉菌屬18s rRNA 基因、新型隱球菌ITS基因和耶氏肺孢子菌mtLSU rRNA 基因中保守的區域設計特異性引物和探針，在樣本 DNA 核酸純化之后采用熒光PCR對DNA進行檢測。

本試劑盒采用實時熒光定量PCR技術，PCR擴增過程中，探針與模板結合，其5’端報告基團被Taq 酶 5’→3’外切核酸酶活性切斷，使報告基團遠離淬滅基團，產生熒光信號。熒光定量PCR儀器根據檢測到的熒光信號自動繪制出實時擴增曲線，并計算出樣本Ct值（每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數）。曲霉菌屬、新型隱球菌、耶氏肺孢子菌熒光標記分別為FAM、VIC、CY5。

本試劑盒反應體系含有dUTP-UDG防污染措施，避免操作產生的假陽性結果；采用內源性內標質控體系，通過內標對待 測樣本的采集、運輸和提取過程進行監控，避免檢測結果的假陰性，內標基因選擇人源管家基因RP，熒光標記為ROX。

4、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的主要原材料

1）主要原材料的選擇

本產品的主要原材料包括：引物、探針、dN（U）TP Mix、 PCR擴增體系、UDG酶、滅活工程菌。這些原材料均為外購方式獲得。引物、探針為開發人自行設計后由專業合成公司合成。

選擇有資質的供應商提供的原料，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商，制定了各主要原材料的質量標準并經檢驗合格。

2）企業參考品和質控品的設置情況企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品以及精密度參考品。 陽性參考品P1~P18為試劑盒覆蓋的3種陽性病原菌。其中 P1~P8為不同菌種曲霉菌屬陽性，其他病原體陰性樣本；P9~P16 為不同型別新型隱球菌陽性，其他病原體陰性樣本；P17~P18 為耶氏肺孢子菌陽性，其他病原體陰性樣本。 陰性參考品N1~N16為種屬相近的或引起癥狀相似的病原菌，分別為白色念珠菌、熱帶念珠菌、甲型流感病毒、腺病毒、 呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、百日咳桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、結核分枝桿菌、少根根霉、 傘枝犁頭霉、近平滑念珠菌、卡氏肺孢子菌、兔源肺孢子菌陽 性樣本。最低檢出限參考品L1~L9為試劑盒覆蓋的3種陽性病原菌，其中L1~L4為不同菌種曲霉菌屬樣本；L5~L8為不同型別新型隱 球菌樣本；L9為耶氏肺孢子菌樣本。 精密度參考品R1~R3為試劑盒覆蓋的3種陽性病原菌混合樣本，R0為生理鹽水。試劑盒包含陽性對照品和陰性對照品各1支，用于檢測過程的質量控制。陽性對照品為添加有內標基因片段的滅活工程菌，覆蓋試劑盒可檢出的所有目標病原菌，陰性對照品為無核酸酶水。

5、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的）生產工藝及反應體系研究

通過對試劑主要生產工藝的研究，確定了最佳生產工藝。 開發人對樣本中可能存在的抑制因素進行了測試，并對樣本核 酸提取方法進行了研究；同時對引物、探針、Taq酶、UDG酶、 dN(U)TP、Mg離子等的濃度和體積進行了優化；對反應條件進行優化，包括樣本采集處理、UDG酶消化時間、變性時間、退火和延伸溫度、循環數的選擇等研究，并通過驗證最終確定了 最佳反應體系。

6、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的分析性能評估

本產品分析性能評估內容主要包括：核酸提取性能、準確性、精密度、最低檢出限、特異性、包容性、競爭性干擾研究 等。開發人開展了有效運行的質量管理體系下生產的三批產品， 在適用機型 ABI 7500 熒光定量 PCR 儀上的性能評估。 在核酸提取效率研究中，比較評估了產品配套使用的核酸提取試劑盒的提取性能，采用不同的提取試劑及痰液消化液， 使用不同濃度、型別/菌種的臨床陽性樣本進行提取效率、核酸 純度、重復性、室間精密度、最低檢出限的研究，結果表明配 套使用的痰液消化液和核酸提取試劑盒可滿足產品使用需求。

在準確度研究中，開發人采用三批成品試劑盒，檢測企業 陽性參考品和陰性參考品，以及不同濃度、不同型別/菌種臨床 陽性樣本和陰性樣本。結果表明陽性符合率和陰性符合率均為100%。

在精密度研究中，開發人采用三批成品試劑盒，對精密度參考品以及不同濃度、不同型別/菌種的陽性臨床樣本及陰性樣 本，進行 20 天的重復性檢測，評估了日內/批內、日內/批間、 批內/日間、批間/日間、室間/不同操作者之間的精密度。結果 顯示：Ct 值變異系數（CV，%）均≤5.0%，試劑盒精密度良好。

在最低檢出限研究中，開發人采用三批成品試劑盒，檢測系列濃度梯度樣本，研究樣本包含目標菌的常見型別/菌種，將達到 95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢出限，并進行最低檢出限驗證。最終確定該產品各靶標最低檢出限定 為曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌均為1500 copies/mL。

在包容性研究中，開發人采用三批成品試劑盒，對收集不同地區的各目標菌的陽性樣本及不同型別病原體進行檢測。曲霉菌屬包括：煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、構 巢曲霉；新型隱球菌包括：新生隱球菌新生變種、新生隱球菌 格魯比變種、新生與格魯比變種雜合體、格特隱球菌；耶氏肺 孢子菌。結果表明試劑盒對不同菌種及不同型別的病原體均能 正確檢出，試劑盒包容性良好。

在特異性研究中，開發人采用三批成品試劑盒，選取與檢測目標核酸序列具有同源性病原體、HIV、惡性腫瘤等免疫力低下患者常見感染病原微生物、近源菌、易引起相同或相似的臨 床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發的其他病原體作為交叉反應研究對象。結果表明：本試劑盒與白色念珠菌、熱帶念珠菌、 光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、毛霉、少根根霉、 傘枝犁頭霉、總狀毛霉、馬爾尼菲青霉菌、斜臥青霉、草酸青 霉、卡氏肺孢子菌、兔肺孢子菌、瓦氏肺孢子菌、鼠肺孢子菌、 無殼散囊菌、莢膜組織包漿菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、唾液鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、表皮葡萄球 菌、流感嗜血桿菌、紋帶棒桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、檸 檬酸桿菌、乳酸桿菌、鮑曼不動桿菌、無毒結核分枝桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺軍團菌、洋蔥伯克霍爾德菌、諾卡菌、粘質沙雷菌、奈瑟氏菌屬、百日咳桿菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體、甲型流感病 毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、 鼻病毒、偏肺病毒、腸道病毒、冠狀病毒、博卡病毒、水痘帶狀病毒、EB 病毒、巨細胞病毒、HIV、肺癌患者樣本驗證均無 交叉反應。

在干擾性研究中，開發人采用三批成品試劑盒，進行了內 源/外源干擾物質研究及競爭性干擾研究，對樣本中可能含有的干擾物質分別進行評價，包括血液、唾液在樣本中的濃度不高于15%時，對檢測結果無顯著影響；針對治療真菌感染或其他 相關疾病的常見藥物如：兩性霉素 B（4mg/L）、卡泊芬凈 （12.4mg/L）、米卡芬凈（13μg/mL）、伏立康唑（4μg/mL）、 伊曲康唑（0.5μg/mL）、氟胞嘧啶（40μg/mL）、他克莫司（15 μg/L）、麥考酚酸（30mg/L）、替諾福韋（1mg/L）、地塞米 松（20ng/mL）、甲強龍（500ng/mL）、多西他賽（10μg/mL）、 培美曲塞（200µg/mL）、二甲雙胍（3μg/mL）、阿卡波糖（100 μg/mL ）、PD-1（60μg/mL）進行驗證，結果顯示內源/外源 干擾物質不會對產品檢測結果產生干擾。 在競爭性干擾研究中，三種目標菌當一種病原體在最低檢 出限濃度附近，其他病原體為高濃度時，各靶標之間不會產生 競爭干擾。故試劑盒檢測結果不受內源/外源干擾物質及競爭性干擾影響。

7、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的陽性判斷值研究

對收集的臨床樣本進行檢測，包括各病原菌的不同型別/菌種、不同濃度的臨床樣本，獲得原始的Ct值用于制定各指標的 陽性判斷值。對于含有陽性和陰性數據的指標，采用 ROC 曲線 法制定各指標的陽性判斷值。并進行了陽性判斷值的驗證，根據驗證結果最終確定了試劑盒的陽性判斷值：曲霉菌屬 Ct≤ 33.7 為陽性；新型隱球菌及耶氏肺孢子菌 Ct≤36 為陽性。

8、曲霉菌屬、新型隱球菌及耶氏肺孢子菌核酸檢測試劑盒的穩定性研究

對本產品的實時穩定性、開瓶穩定性、反復凍融穩定性、 運輸穩定性以及樣本穩定性進行了研究，確定了在各種條件下 本產品及樣本的有效保存時間。

實時穩定性：試劑盒儲存于-20℃±5℃。分別于不同時間點，對其陰陽性符合率、最低檢出限和精密度進行考察。結果 表明試劑盒在-20℃±5℃條件下，試劑盒有效期為 12 個月。

開瓶穩定性：試劑盒開瓶后按照規定儲存在 2℃~8℃，試劑開瓶后分別于不同時間，對其陰陽性符合率、最低檢出限和精密度進行考察。結果表明試劑盒開瓶后在 2℃~8℃條件下保 存，試劑盒有效期為 15 天。

反復凍融穩定性：試劑盒按照規定儲存在-20℃±5℃，試劑盒凍結后再取出置于室溫解凍，如此反復凍融數次。將凍融后的產品在不同時間點進行陰陽性符合率、最低檢出限、精密 度的考察。結果表明，試劑使用過程中凍融次數不得超過 7 次。

運輸穩定性：隨機各抽取 3 批多盒試劑，采用模擬運輸的方法進行研究。運輸目的地選擇吉林省長春市以及廣東省廣州市到達目的地后折返。運輸結束后將試劑放置至有效期末，按技術要求對產品外觀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、 精密度和最低檢出限指標進行檢測，檢測結果均符合技術要求； 對樣本和核酸保存穩定性及凍融次數進行了研究。結果表明：樣本在 2℃~8℃條件下可以保存 72 小時，-20℃±5℃條件 下可以保存 12 個月，-90℃~-70℃條件下可保存 24 個月。凍存的樣本反復凍融后應充分混勻，避免5次以上反復凍融。提取后的核酸可于-20℃±5℃條件下保存12個月，反復凍融不超過 5 次。