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通常，藥品中的活性成分可以通過(guò)全合成或者以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以獲得。而上述這兩種情況，均需要使用多種化學(xué)試劑并經(jīng)過(guò)一步或多步化學(xué)反應(yīng)。因此，即使經(jīng)過(guò)純化步驟，在最終的原料或制劑中，還會(huì)存在一定量的和藥效無(wú)關(guān)的雜質(zhì)。同時(shí)，在藥品的制劑或儲(chǔ)存過(guò)程中，也可能生成一定量的雜質(zhì)。

這些雜質(zhì)和藥效無(wú)關(guān)，同時(shí)可能具有毒性，甚至具有遺傳毒性和致癌性[1]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)等各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)自2006年已開(kāi)始持續(xù)關(guān)注原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)的情況，及可能對(duì)人體健康造成的負(fù)面影響。

遺傳毒性雜質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，造成DNA突變并伴有致癌性危害人類(lèi)健康的物質(zhì)。其對(duì)DNA的損害包括染色體斷裂、DNA重組及復(fù)制過(guò)程中共價(jià)鍵的插入和修飾，也包括在細(xì)胞水平上產(chǎn)生遺傳毒性物質(zhì)而造成的突變。由于微量水平的遺傳毒性物質(zhì)也會(huì)對(duì)服藥者造成不可逆轉(zhuǎn)的危害，可能會(huì)引發(fā)腫瘤甚至癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且該致癌風(fēng)險(xiǎn)可能與劑量沒(méi)有相關(guān)性，存在遺傳毒性化合物在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)可通過(guò)遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)和控制極其重要。

遺傳毒性雜質(zhì)的種類(lèi)較多，有黃曲霉素類(lèi)、亞硝胺化合物、烷基-氧化偶氮基化合物，磺酸酯類(lèi)、氯代烷烴類(lèi)、苯胺類(lèi)、硝基苯、多環(huán)芳烴以及疊氮化物等。由于黃曲霉素類(lèi)、亞硝基化合物、烷基-氧化偶氮基化合物毒性較強(qiáng)，屬于特殊關(guān)注隊(duì)列(表1)。

近年來(lái)，亞硝胺化合物殘留而引發(fā)藥品召回的事件頻發(fā)。2018年，浙江省華海藥業(yè)在纈沙坦原料藥中檢測(cè)出微量的亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)后，亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)事件引起了業(yè)內(nèi)的普遍關(guān)注。2019年3月，F(xiàn)DA公布氯沙坦鉀片中亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(N-Nitroso-Nmethyl-4-aminobutyric acid，NMBA)超出暫定控制限度(0.96 ppm)。同年9月，F(xiàn)DA發(fā)布安全警告，雷尼替丁中檢出亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)NDMA，之后也導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)品被召回。隨后FDA又在降糖藥二甲雙胍中檢出微量NDMA。2020年7月，WHO公布在賽諾菲公司的利福平、利福噴丁中檢出亞硝胺雜質(zhì)MNP、1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪(1-cyclopentyl-4-nitrosopiperazine，CPNP)，隨后FDA也公布了其暫定限度為5和20 ppm。2021年，因含有亞硝胺化合物N-亞硝基-伐尼克蘭，輝瑞公司召回戒煙藥Chantix。次年又因亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)超標(biāo)，長(zhǎng)效降壓藥鹽酸普萘洛爾被召回。上述事件總結(jié)見(jiàn)圖1。此類(lèi)亞硝胺雜質(zhì)事件頻發(fā)，增加了患者使用藥物的風(fēng)險(xiǎn)，也給企業(yè)帶來(lái)了無(wú)法估計(jì)的損失，同時(shí)也給制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)敲響了警鐘。

本綜述希望通過(guò)對(duì)藥品中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的來(lái)源、檢測(cè)方法、控制策略和清除的方法進(jìn)行探討，為相關(guān)人員提供參考。

 

一、 亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管

20世紀(jì)以前，對(duì)于藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管的制度和措施幾乎空白。隨著檢測(cè)技術(shù)和監(jiān)管理念的發(fā)展，近年來(lái)，各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的藥物監(jiān)管措施的逐漸完善。2002年，EMA的專(zhuān)利藥物委員會(huì)(Committee forProprietary Medicinal Products，CPMP)后更名為人用藥物委員會(huì)(Committee for Human Medicinal Products，CHMP)發(fā)布關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)的意見(jiàn)書(shū)[2]。該意見(jiàn)書(shū)按照雜質(zhì)是否存在有證據(jù)的閾值而將遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)：①有足夠的研究證據(jù)支持其閾值的雜質(zhì)，建議參照ICH Q3C中二類(lèi)溶劑的方法進(jìn)行控制；②無(wú)充分閾值研究證據(jù)的雜質(zhì)，采用“最低技術(shù)可行”(as low as technically feasible，ALATF)的原則進(jìn)行控制。

 

2004年，EMA發(fā)布遺傳毒性雜質(zhì)限度指南(草案)，對(duì)意見(jiàn)書(shū)進(jìn)行了修改。默認(rèn)完全消除遺傳毒性雜質(zhì)的引入風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，改以“最低合理可行”原則(as low as reasonably practical，ALARP)替代了“最低技術(shù)可行”(ALATF)原則，建議用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)作為遺傳毒性雜質(zhì)的可接受限度[3]。TTC根據(jù)半數(shù)致癌劑量(median toxic dose，TD50)的五萬(wàn)分之一為攝入量進(jìn)行線性外推，從而得到十萬(wàn)分之一(10-5)致癌率的攝入量，并以此數(shù)值作為每人每天最高攝入量[4]。上述TD50的數(shù)據(jù)通常來(lái)源于致癌性強(qiáng)度數(shù)據(jù)庫(kù)(carcinogenicitypotency database，CPDB)以及嚙齒類(lèi)動(dòng)物致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)[5]。

由于部分遺傳毒性雜質(zhì)致癌性強(qiáng)，危害較大，即使低于“毒理學(xué)關(guān)注閾值”也會(huì)對(duì)人體有較大致癌風(fēng)險(xiǎn)，所以美國(guó)藥品研究與制造企業(yè)協(xié)會(huì)(Pharmaceutical Research and Manufacturers ofAmerica，PhRMA)又提出了“五分類(lèi)”系統(tǒng)，將遺傳毒性雜質(zhì)分為5類(lèi)。2014年，人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(the international council for harmonisation oftechnical requirements for pharmaceuticals for humanuse，ICH)在EMA、PhRMA和FDA的基礎(chǔ)上頒布了關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)指南ICH M7，對(duì)“五分類(lèi)”[6]做了一些增補(bǔ)，見(jiàn)表2。

 

2017年，ICH評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性(致突變)雜質(zhì)的ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險(xiǎn)高的N-亞硝基類(lèi)化合物列為“特殊關(guān)注隊(duì)列”，并根據(jù)其致癌性相關(guān)分析，將其列為“具有已知致癌致突變性”的Ⅰ類(lèi)雜質(zhì)[7]。

根據(jù)ICH M7和EMA相關(guān)指南，作為“特殊隊(duì)列”中的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)應(yīng)根據(jù)藥物每日最高使用劑量計(jì)算終身使用的藥物中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的臨時(shí)限度。也可根據(jù)TD50等其毒理學(xué)參數(shù)計(jì)算每日允許暴露量(permitted daily exposure， PDE)或每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)。然后在此基礎(chǔ)上，根據(jù)每日用藥量和用藥周期對(duì)其限度進(jìn)行確定[4]。若在CPDB及嚙齒類(lèi)動(dòng)物致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中未查見(jiàn)亞硝胺雜質(zhì)的TD50值，可以采用相似結(jié)構(gòu)化合物的TD50值計(jì)算雜質(zhì)限度。

當(dāng)然，存在著一種藥物中含有多種遺傳毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。EMA安全工作小組(safety workingparty，SWP)對(duì)于含有兩種及以上的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的限度控制，提出了兩種監(jiān)管策略[13]：第一種策略是按照致癌風(fēng)險(xiǎn)最強(qiáng)的一種亞硝胺雜質(zhì)的限度進(jìn)行控制；另一種策略將總含量控制在罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)不超過(guò)10-5的水平。同時(shí)，SWP提供一種替代方法，建議為每種亞硝胺雜質(zhì)設(shè)定一個(gè)特定的限值，從而確保所有檢出的亞硝胺雜質(zhì)的總和不超過(guò)10-5的總風(fēng)險(xiǎn)水平。而對(duì)于毒理學(xué)數(shù)據(jù)不足的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的控制限度，比如N-亞硝基甲乙胺(N-nitroso-methylethylamine，NMEA)、N-亞硝基二丙胺(N-nitrosodi-N-propylamine，NDPA)胺類(lèi)化合物，EMA推薦使用結(jié)構(gòu)上與其最為接近的亞硝胺類(lèi)化合物的TD50為基礎(chǔ)估算其限度[5]。而對(duì)于短期服用藥物，ICH M7提出了可使用小于壽命(less thanlifetime，LTL)的方法計(jì)算其限度。但是，當(dāng)前多數(shù)CHMP專(zhuān)家基于亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)暴露量與DNA損傷無(wú)嚴(yán)格線性關(guān)系，同時(shí)經(jīng)過(guò)LTL計(jì)算后，限度偏高，造成短期風(fēng)險(xiǎn)增大。

我國(guó)對(duì)于遺傳毒性雜質(zhì)的研究起步較晚，2017年我國(guó)加入ICH后，相繼頒布了指導(dǎo)原則。2019年1月，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則審核稿，指導(dǎo)遺傳毒性雜質(zhì)的分類(lèi)和控制，《中國(guó)藥典》2020版四部通則中新增了該指導(dǎo)原則[8]。2020年5月，我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品藥審中心網(wǎng)站發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，該原則對(duì)準(zhǔn)備注冊(cè)申請(qǐng)上市和已上市化學(xué)藥品中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的研究和控制提供了指導(dǎo)原則[9]。

 

二、亞硝胺類(lèi)傳毒性雜質(zhì)的來(lái)源

藥品中亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生的原因復(fù)雜且多樣。從產(chǎn)生機(jī)理角度分析，亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理分為兩大類(lèi)：一是經(jīng)典的亞硝化反應(yīng)。如不同胺類(lèi)化合物與不同亞硝化試劑相互作用發(fā)生的亞硝化反應(yīng)，主要以仲胺和叔胺化合物為主，亞硝化試劑主要包括亞硝酸根離子、亞硝酰鹵化物、亞硝酸酯、三氧化二氮和四氧化二氮等。二是非經(jīng)典類(lèi)的亞硝化反應(yīng)。硝基胺高溫下的還原反應(yīng)，硝基胍用鋅粉還原可形成亞硝胺；肼類(lèi)化合物如偏二甲肼發(fā)生的氧化反應(yīng)；還有腙臭氧分解成亞硝胺；有機(jī)金屬的亞硝化；將格氏試劑加入到一氧化氮中可以得到亞硝基羥胺等。其中常見(jiàn)的反應(yīng)就是亞硝化反應(yīng)，任何含N-H的化合物都可能發(fā)生亞硝化反應(yīng)[10]，比如胺、(雜)酰胺、氨基甲酸酯、羥胺、羥胺醚、肼、腙、酰肼、脲和胍。上述反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。

 

藥物在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏的過(guò)程中均有可能產(chǎn)生亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)[11-12]。華海藥業(yè)在纈沙坦的合成路線中使用了疊氮化鈉，其溶劑為N,N-二甲基甲酰胺(N,Ndimethylformamide，DMF)。該合成路線相對(duì)于之前的合成路線，具有收率高的特點(diǎn)。但經(jīng)研究表明，溶劑DMF在合成過(guò)程中，會(huì)降解生成二甲胺。二甲胺會(huì)與淬滅過(guò)量的疊氮化鈉使用的亞硝酸鈉發(fā)生亞硝化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)NDMA[6]。強(qiáng)效組胺H2受體拮抗劑雷尼替丁本身結(jié)構(gòu)中的硝基和二甲胺發(fā)生也會(huì)亞硝化反應(yīng)，降解產(chǎn)生NDMA。與雷尼替丁結(jié)構(gòu)相似，二甲雙胍結(jié)構(gòu)中也含有一個(gè)二甲胺，容易與亞硝酸鹽生成亞硝胺雜質(zhì)。

基于以上機(jī)理，亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)來(lái)源主要有3種途徑：一是來(lái)源于生產(chǎn)工藝。在生產(chǎn)過(guò)程中引入了胺類(lèi)化合物或亞硝化試劑，如起始原料、反應(yīng)物、中間體以及藥物合成中發(fā)生的副反應(yīng)。此外還應(yīng)考慮某些溶劑、催化劑等也會(huì)降解生成仲胺或叔胺化合物。沙坦類(lèi)中NDMA的來(lái)源就是生產(chǎn)工藝使用了胺類(lèi)和亞硝酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生的[13]。并且生產(chǎn)過(guò)程使用的溶劑DMF和N-甲基吡咯烷酮的水解或者熱降解分別產(chǎn)生仲胺如二甲胺和甲基丁胺，隨后發(fā)生N-亞硝化反應(yīng)，最終產(chǎn)生NDMA和NMBA；二是可能來(lái)源于儲(chǔ)存過(guò)程、包裝材料以及并線生產(chǎn)等。含有硝化纖維的泡罩包裝也會(huì)生成亞硝胺雜質(zhì)[13]；三是來(lái)源于起始物、中間體或原料的降解產(chǎn)物。比如雷尼替丁中的NDMA雜質(zhì)是在儲(chǔ)存過(guò)程中降解產(chǎn)生的[14]，尤其高溫加熱時(shí)生成的亞硝胺雜質(zhì)更多[15-16]。

遺傳毒性雜質(zhì)具有重大的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，是需要重點(diǎn)控制的雜質(zhì)，對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)控制的水平可以反映藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的水平[17]。因此為了人類(lèi)的健康和安全，有必要了解其產(chǎn)生機(jī)理并建立一種靈敏的方法來(lái)檢測(cè)和定量藥品和藥品中的遺傳毒性雜質(zhì)。同時(shí)對(duì)雜質(zhì)的清除措施也需十分明確。

 

三、亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的清除

2020年6月，EMA就上市許可持有人如何避免在人用藥中產(chǎn)生亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)提出指導(dǎo)意見(jiàn)：調(diào)整生產(chǎn)工藝，提前預(yù)防亞硝胺化合物的生成；做好合成路線、起始原料、中間體、原料(溶劑、試劑、催化劑等)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，找出生成亞硝胺化合物的潛在原因[13]；如若通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)確有亞硝胺化合物存在，應(yīng)考慮改變生產(chǎn)工藝、原料和中間體、原材料或初級(jí)包裝(如含有硝化纖維的泡罩包裝等)，以避免使用亞硝化劑；如果證明亞硝化劑與溶劑、試劑和催化劑的結(jié)合在整個(gè)過(guò)程中不可避免，則應(yīng)在原料藥和制劑生產(chǎn)中實(shí)施適當(dāng)?shù)目刂拼胧13]。

FDA在21世紀(jì)提出“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(quailtyby design，QbD)理念，其被定義為基于一種科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理之上，預(yù)先定義好目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量并強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品與工藝的理解及控制的一個(gè)系統(tǒng)的研發(fā)方法。對(duì)潛在遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的策略就是利用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)提供更詳盡的對(duì)工藝的理解，最終確定雜質(zhì)產(chǎn)生的臨界區(qū)域。Madasu等[18]采用上述策略，設(shè)計(jì)了氯沙坦鉀鹽的5步合成法。從設(shè)計(jì)源頭避免并控制雜質(zhì)的產(chǎn)生，才是控制雜質(zhì)產(chǎn)生的根本途徑。藥品在設(shè)計(jì)生產(chǎn)時(shí)，如避免不了雜質(zhì)的產(chǎn)生，也應(yīng)盡量控制雜質(zhì)在最終反應(yīng)4步以外產(chǎn)生[6]，再設(shè)立雜質(zhì)清除步驟。

 

四、亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)分析方法研究進(jìn)展

由于亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)在極低的濃度就具有較強(qiáng)的毒性，同時(shí)該類(lèi)雜質(zhì)具有低分子量、高親水性的特點(diǎn)，是檢測(cè)的難點(diǎn)。目前關(guān)于藥物中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的檢測(cè)方法，主要包括如高效液相色譜-紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)[19-21]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)[22-24]、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry，GC-MS)等[25-30]。

4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是藥物分析中最為普遍的方法，其具有靈敏度高，專(zhuān)屬性好的優(yōu)點(diǎn)[8]。70%以上的化合物都可以用高效液相色譜分離。由于亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的高親水性，十八烷基硅烷(octadecylsilyl，ODS)或苯基硅烷鍵合相色譜柱常用于亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的分離[19]。常使用的檢測(cè)器包括紫外檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器等。

4.1.1 紫外檢測(cè)器

由于其簡(jiǎn)便性和可及性，帶紫外的液相色譜可應(yīng)用于較高濃度的遺傳毒性雜質(zhì)測(cè)定的快速篩查和定量。Sayaka-M等[19]采用Inertsil ODS-3柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，GL Science)建立了高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器(photo-diodearray detector，PDAD)檢測(cè)纈沙坦中NDMA的定量方法。該方法檢測(cè)限為0.057~0.17 ppm，定量限為0.19~0.57 ppm。上述方法可用于纈沙坦原料藥和市售產(chǎn)品中NDMA雜質(zhì)的快速篩查和定量。Kunjan等[20]采用C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱建立了HPLCUV同時(shí)測(cè)定纈沙坦中6種亞硝胺雜質(zhì)的定量方法，其檢測(cè)限為6~13 ppm，定量限為20~41 ppm。范婷婷[21]等采用SHISEIDO C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm ，5 µm)建立了HPLC-PDAD測(cè)定纈沙坦中N-二甲基亞硝胺含量。檢測(cè)限為0.01 ppm，定量限為0.03 ppm。

4.1.2 熒光檢測(cè)器與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器

當(dāng)然，紫外檢測(cè)器用于亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的檢測(cè)存在著很多挑戰(zhàn)。首先需要對(duì)液相色譜條件優(yōu)化，比如流動(dòng)相組成、pH等需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間。此外，HPLC-UV方法的檢測(cè)限和定量限也較高。為了降低檢測(cè)限和定量限以達(dá)到遺傳毒性雜質(zhì)測(cè)定的需要，可以通過(guò)熒光衍生化法(fluorescence derivatizatio，F(xiàn)LD)[31,34]或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法(HPLC-PR-CL)[32]進(jìn)行檢測(cè)。

由于亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中無(wú)熒光基團(tuán)[33]，因此需采用熒光衍生化法進(jìn)行熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)靈敏度。Zhao等[34]采用柱前熒光標(biāo)記建立了高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)測(cè)定食品中N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine，NPYR)、N-亞硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine，NDEA)、N-亞硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine，NDBA)和N-亞硝基二丙胺(N-nitroso-di-N-propylamine，NDPA)4種亞硝胺雜質(zhì)方法。該方法檢測(cè)限在1.3~2.5 ng/L范圍內(nèi)。Takahiro等[32]采用Capcell Pak C18 MGII(5 μm，4.6 mm，250 mm或100 mm)色譜柱建立了高效液相色譜-光化學(xué)反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光法(HPLC-PR-CL)分析再生水中NDMA的含量。檢測(cè)限為2 ng/mL。該方法與固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相比具有相同的準(zhǔn)確度。但其具有比該法樣品用量小、分析時(shí)間快、操作方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

上述方法論述了對(duì)藥品、食品和水中亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法和檢測(cè)限，檢測(cè)限可達(dá)到1~13 ng/mL不等。可根據(jù)遺傳毒性雜質(zhì)的性質(zhì)和含量選擇合適的檢測(cè)方式。但考慮到遺傳毒性雜質(zhì)的含量通常較低，常規(guī)液相色譜法只適用于含量較高的遺傳毒性雜質(zhì)的定量，因此HPLC的檢測(cè)限也往往達(dá)不到要求，需要靈敏度更高的檢測(cè)器來(lái)解決。

4.1.3 質(zhì)譜檢測(cè)器

由于較高的靈敏度，LC-MS法已被廣泛探索用于分析含量較低的遺傳毒性雜質(zhì)當(dāng)中。表3總結(jié)了FDA先后建立了液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem high resolution massspectrometry，LC-HRMS)對(duì)血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類(lèi)藥物、雷尼替丁、利福平、利福噴丁中遺傳毒性藥物檢測(cè)方法。

采用電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)的質(zhì)譜多為高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜。

 

FDA公布的幾種亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法為高分辨質(zhì)譜。因其分辨率高、質(zhì)量精密度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在藥品檢測(cè)中。Wohlfart等[22]通過(guò)FDA的方法對(duì)15批利福平膠囊中的遺傳毒性雜質(zhì)MNP檢測(cè)。該方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，檢測(cè)結(jié)果為0.7~5.1 ppm。其中一份樣品的測(cè)定結(jié)果略微大于FDA規(guī)定的上限(5 ppm)。同時(shí)，該研究指出，F(xiàn)DA采用的外標(biāo)單點(diǎn)法可能由于個(gè)別樣品中MNP濃度超過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)曲線法的線性范圍，而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。劉博等[23]建立LC-ESI-HRMS法測(cè)定54批鹽酸二甲雙胍緩釋片中7種亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)方法。此外，LCMRM-MS也廣泛應(yīng)用于藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)中。Tao等[35]建立了HPLC-ESI-MS/MS方法檢測(cè)30批利福平制劑中遺傳毒性雜質(zhì)MNP的含量。該方法與六通閥切換相結(jié)合，避免了利福平進(jìn)入質(zhì)譜儀造成污染。

采用LC-MS技術(shù)對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，藥品中的輔料、雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)待測(cè)成分產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。有文獻(xiàn)表明，與ESI離子源相比，使用大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較小[24]。同時(shí)，APCI源的靈敏度要高于ESI源[24,32,36]，且APCI源更適合一些難離子化的化合物[37]。

APCI離子源在藥物雜質(zhì)檢測(cè)中應(yīng)用范圍較廣，常見(jiàn)的化學(xué)藥品(雷尼替丁、二甲雙胍、沙坦類(lèi)等)中的亞硝胺化合物都可采用APCI離子源檢測(cè)[38-41]。此外，APCI離子源還可用于生物制品中遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，Luo等[24]采用鹽析液液萃取(salting-outliquid-liquid extraction，SALLE)前處理技術(shù)建立了SALLE-LC-APCI-MS/MS法測(cè)定單克隆抗體中的13種亞硝胺雜質(zhì)的方法。這是首次為生物制藥中亞硝胺遺傳毒性雜質(zhì)的定量提供了一種可靠而靈敏的方法。

表4總結(jié)了上述文獻(xiàn)中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)LC-MS檢測(cè)方法。

 

綜上所述，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)由于具有靈敏度高等特點(diǎn)，已成為ppm級(jí)別的遺傳毒性雜質(zhì)定量檢測(cè)的常用方法。色譜柱多采用C18或苯基柱。APCI源和ESI源均可應(yīng)用于藥物中亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，但采用APCI源的基質(zhì)效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)通常低于采用ESI源。

由于遺傳毒性雜質(zhì)含量較低，為了保證較好檢測(cè)結(jié)果，往往需要向質(zhì)譜中注入較高濃度的樣品。但是，對(duì)于沒(méi)有經(jīng)過(guò)前處理的樣品，直接進(jìn)樣會(huì)使高濃度的主成分進(jìn)入離子源，對(duì)質(zhì)譜儀造成污染。因此，可以通過(guò)固相萃取(solid phase extraction，SPE)、固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)和分散液-液微萃取等方法或閥切換技術(shù)連接[38,40,42]在線樣品處理技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

4.1.4 氣相色譜法

雖然質(zhì)譜串聯(lián)熱能分析儀(gas chromatographytandem thermal energy analyzer, GC-TEA)聯(lián)用也可應(yīng)用于遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)中，但 GC-MS更為普遍。

表5總結(jié)了FDA先后建立的直接進(jìn)樣(directinjection, DI)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(DI-GC-MS)和頂空(headspace, HS)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HS-GC-MS)對(duì)沙坦類(lèi)藥物中亞硝胺類(lèi)遺傳毒性藥物的檢測(cè)方法。

 

DI-GC-MS精密度較高，重復(fù)性好，適合液體進(jìn)樣，但進(jìn)樣時(shí)可能會(huì)有主成分造成的干擾。目前DIGC-MS已用于很多藥品(纈沙坦、西洛他唑、蘋(píng)果酸舒尼替尼、奧美沙坦酯、阿莫西林等)中遺傳毒性雜質(zhì)的定量檢驗(yàn)[43-45]。

頂空進(jìn)樣法適合揮發(fā)性較大的雜質(zhì)。該方法將樣品置于頂空瓶中，只抽取樣品中揮發(fā)性氣體進(jìn)行測(cè)定，大大減少了樣品基質(zhì)對(duì)被分析物的干擾。同時(shí)，該方法具有無(wú)須復(fù)雜的前處理過(guò)程且操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。Wichitnitnithad等[25]建立了HS-GC-MS法檢測(cè)10批纈沙坦原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)含量的方法。Lee等[26]建立了無(wú)溶劑(SF)-HS-GC/MS對(duì)原料藥和制劑中NDMA進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)的HS-GC/MS和LC-MS/MS方法相比，該法對(duì)NDMA的快速篩選更加方便，不需要樣品前處理。具有較高的靈敏度和選擇性。

需要注意的是，無(wú)論使用直接進(jìn)樣還是頂空進(jìn)樣，GC-MS最大的挑戰(zhàn)在于待測(cè)主成分的遺傳毒性雜質(zhì)在高溫下有增加的風(fēng)險(xiǎn)。Lim等[27]建立了一種GC-MS/MS同時(shí)測(cè)定沙坦類(lèi)、二甲雙胍和雷尼替丁等8種藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的方法。該方法采用沉淀法和固相萃取法進(jìn)行前處理。該方法在去除藥物和輔料的同時(shí)，NDMA和NDEA得到了有效的回收。是一種方便可行、靈敏度高、專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確性和精密度較高的檢測(cè)方法。該法通過(guò)前處理除去了主成分，使得雷尼替丁這種受熱易分解的藥物也可用GC-MS/MS法檢測(cè)，為此類(lèi)藥物的檢測(cè)提供了可替代的方法。Alshehri等[28]建立了HS-SPME-GC-MS法檢測(cè)雷尼替丁中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA。該法采用固相微萃取技術(shù)，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，采用低溫從而避免了雷尼替丁受熱分解，可用于其他受熱易分解藥物的遺傳毒性雜質(zhì)檢測(cè)。Chang等[29]采用固相萃取前處理法建立了HS-SPME-GC-MS/MS檢測(cè)44種藥物中14種亞硝胺的方法。

GC也可與TEA聯(lián)用，但該儀器價(jià)格昂貴，故適用范圍比較小。GC-TEA的原理是熱能分析儀能特異性催化亞硝胺類(lèi)化合物裂解成一氧化氮(NO)基團(tuán)，與臭氧反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生近紅外光，利用光電倍增管檢測(cè)，從而對(duì)亞硝胺類(lèi)化合物的含量進(jìn)行測(cè)定。咸瑞卿等[30]建立了GC-TEA法檢測(cè)13批纈沙坦原料藥及其制劑中 NDMA含量。GC-TEA 法相對(duì)于GC-MS，減少了背景和基質(zhì)干擾，避免了采用GC-MS法時(shí)定性、定量離子保留時(shí)間附近有較多干擾峰的問(wèn)題，保證了低濃度樣品的定量準(zhǔn)確性。但由于其價(jià)格昂貴，通常不作為亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的檢測(cè)方法。

表6總結(jié)了上述文獻(xiàn)中亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)GC-MS檢測(cè)方法。

 

以上內(nèi)容總結(jié)了近年來(lái)氣相色譜串聯(lián)熱能分析儀和質(zhì)譜檢測(cè)亞硝胺類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的分析方法。GC-MS相對(duì)于LC-MS具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，雖然應(yīng)用范圍較LC-MS窄，主要適用于易揮發(fā)性成分的分離檢測(cè)，但也是遺傳毒性雜質(zhì)檢測(cè)不可或缺的方法。直接進(jìn)樣法相對(duì)于頂空進(jìn)樣法的靈敏度高，但可能會(huì)有主成分或者輔料等干擾造成的基質(zhì)效應(yīng)，該基質(zhì)效應(yīng)是待測(cè)樣品與硅醇基或玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所導(dǎo)致。這些基質(zhì)成分有利于被測(cè)樣品轉(zhuǎn)移至檢測(cè)器，從而導(dǎo)致較高的分析信號(hào)[46-47]。因此，GC-MS中的基質(zhì)效應(yīng)更多表現(xiàn)為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性。為了避免這種干擾，要考慮色譜條件和前處理方法的優(yōu)化。選擇合適的內(nèi)標(biāo)可以校正測(cè)量過(guò)程產(chǎn)生的誤差，是避免基質(zhì)效應(yīng)的有效方法。同位素內(nèi)標(biāo)法常用于計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。除此之外，還可采用固相萃取法、沉淀法等除去主成分和輔料的干擾。頂空進(jìn)樣收集揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，無(wú)須前處理。同時(shí)結(jié)合固相微萃取技術(shù)，可顯著降低復(fù)雜基質(zhì)的干擾，增加檢測(cè)靈敏度，并且適用于受熱不穩(wěn)定樣品的檢測(cè)。SPME是一種附加在注射針上的輔助纖維萃取技術(shù)，可用于在樣品分析前提取目標(biāo)分析物[29]。SPME結(jié)合HS-GC-MS法已廣泛應(yīng)用在遺傳毒性雜質(zhì)檢測(cè)中。

由于微量水平的遺傳毒性物質(zhì)也會(huì)對(duì)服藥者造成不可逆轉(zhuǎn)的危害，可能會(huì)引發(fā)腫瘤甚至癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且其引發(fā)的致癌風(fēng)險(xiǎn)可能與使用的劑量沒(méi)有相關(guān)性，存在遺傳毒性化合物在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)有通過(guò)遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大的風(fēng)險(xiǎn)。因此各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制。而對(duì)于制劑中的遺傳毒性雜質(zhì)檢測(cè)，由于成分復(fù)雜，制劑中的輔料可能會(huì)引起基質(zhì)效應(yīng)，從而影響遺傳毒性雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。目前，多是根據(jù)不同品種、不同生產(chǎn)企業(yè)去建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，使得監(jiān)管效率降低。可以嘗試通過(guò)在線閥切換、固相萃取等方式建立前處理方法，使得檢測(cè)方法更有通用性。此外，近年來(lái)，隨著各國(guó)對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的研究逐漸深入，對(duì)于遺傳毒性雜質(zhì)認(rèn)知也發(fā)生了變化。監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的控制也更加科學(xué)、合理。生產(chǎn)企業(yè)通過(guò)采用“避免-控制-清除”的策略，使實(shí)際工藝中所有可能涉及的遺傳毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)得到明確鑒別和控制，是達(dá)到監(jiān)管期望的有效途徑。

本文從監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略、遺傳毒性雜質(zhì)來(lái)源、檢測(cè)方法及清除策略4個(gè)方面進(jìn)行了綜述，為藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制/清除、檢測(cè)提供了參考和依據(jù)。

 

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