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嘉峪檢測網 2024-08-12 10:36
摘要
遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內容，與致癌性、生殖毒性研究密切相關。遺傳毒性試驗目的是檢測受試物的致突變性，預測受試物的致癌性，對受試物的遺傳毒性潛在性進行全面評價是藥物進入臨床試驗及上市的重要環節。遺傳毒性標準試驗組合包含體內和體外試驗，測試終點多樣，本文從人員資質、實驗室管理、給藥制劑、實驗系統、試驗實施關鍵階段等方面闡述遺傳毒性評價研究的關注點，為遺傳毒性研究實施提供借鑒。研究機構應嚴格遵循藥物非臨床研究質量管理規范(good laboratory practice for nonclinical laboratory studies，GLP)實施評價工作，不斷提高遺傳毒性試驗質量。
關鍵詞
藥物; 遺傳毒性; 體內; 體外; 非臨床研究質量管理規范
遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內容，與致癌性、生殖毒性研究密切相關。遺傳毒性試驗目的是檢測受試物的致突變性，預測受試物的致癌性，對受試物的遺傳毒性潛在性進行全面評價是藥物進入臨床試驗及上市的重要環節。進行藥物遺傳毒性評價研究遵循的指導原則是《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》(以下簡稱指導原則)[1-2]，其中對標準試驗組合、實驗系統、劑量設計、方法、結果判定等都有較詳細說明和規定，試驗實施過程中應遵照執行。藥物遺傳毒性試驗必須執行《藥物非臨床研究質量管理規范》(good laboratory practice for nonclinical laboratory studies，GLP)，擬用于藥品注冊申請的遺傳毒性試驗，應當在通過藥物GLP認證的非臨床安全性評價研究機構實施[3-7]。遺傳毒性試驗周期較短，但包括體內和體外試驗的標準試驗組合，實驗系統從原核細胞到真核細胞再到哺乳動物，且體外試驗還需在添加和不添加代謝活化產物的條件下進行，所用試劑和儀器也種類繁多，具有操作步驟復雜、記錄繁瑣、測試終點多樣性等特點，具有一定的特殊性。本文從人員資質、實驗室管理、給藥制劑、實驗系統、試驗實施關鍵階段等方面闡述遺傳毒性評價的關注點，為遺傳毒性研究實施提供借鑒。研究機構應嚴格遵循GLP實施評價工作，不斷提高遺傳毒性試驗質量。
1、遺傳毒性試驗分類
遺傳毒性試驗可分為體外和體內試驗兩大類[1-2]。體外試驗主要包括: ①細菌回復突變試驗。②體外哺乳類細胞染色體畸變試驗。③體外哺乳動物細胞微核試驗。④體外小鼠淋巴瘤細胞胸苷激酶(thymidine kinase，Tk)基因突變試驗。⑤熒光原位雜交(FISH)。體內試驗主要包括: ⑥體內微核試驗。⑦體內中期相細胞染色體畸變試驗。⑧體內彗星試驗。⑨體內堿洗脫試驗。⑩轉基因小鼠體內突變試驗。
2、人員資質
遺傳毒性試驗無論是組合一還是組合二，細菌回復突變試驗和體內動物試驗是必選試驗，如果采用組合一進行評價，還會涉及體外細胞試驗，因此從事遺傳毒性試驗的人員應接受過與其工作相關的專業和技能培訓，具備所承擔工作需要的知識、經驗和能力。例如: 從事細胞、細菌體外試驗的人員應具有微生物學、細胞生物學等學科知識，并經過專業化培訓，熟練掌握細菌、細胞的復蘇、培養、傳代、凍存等技術，配制給藥制劑的人員在配制過程中也應無菌操作; 從事體內動物試驗的人員，則應先接受動物專業知識的理論培訓，上崗前動物稱重、給藥、臨床觀察、安樂死等操作也必須經過培訓和考核; 對于閱片人員，如顯微鏡下分析染色體結構畸變的類型、計數未成熟紅細胞及微核，還必須經過更長時間的培訓，考核合格后方可進行相關操作。此外，人員應定期體檢并評估體檢結果，確保身體狀況不能影響研究工作[8]。
3、設施
開展遺傳毒性試驗，要具備細胞實驗室、細菌實驗室、屏障環境動物房等設施。細胞實驗室、細菌實驗室應定期檢測空氣潔凈度及沉降菌，測試要求可參考GB50591-2010《潔凈室施工及驗收規范》、GB/T16292-2010《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子的測試方法》、GB/T16294-2010《醫藥工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法》[9-11]等。動物飼養環境指標如溫度、濕度、壓差、噪聲、照度、潔凈度、沉降菌等應符合GB14925-2023《實驗動物環境及設施》[12]要求。此外，傳遞物品時會用到傳遞窗紫外線燈對物品進行消毒，需對紫外線燈的消毒效果進行驗證并定期檢測紫外線燈的輻照強度。
4、實驗室管理
4.1 儀器設備
遺傳毒性試驗實施過程中用到的儀器種類繁多，如各種溫度范圍的冰箱、高壓滅菌器、生化培養箱、二氧化碳培養箱、水浴鍋、生物安全柜、電子天平、移液器、離心機、液氮罐、pH計、攪拌器、顯微鏡等，每臺/套儀器均要有明確的儀器責任人，放置地點合理且有狀態標識，并定期進行清潔、維護保養與校準、確認或驗證。為方便管理，最好建立一個清晰的儀器臺賬，用于記錄各個儀器的名稱、型號、生產廠商、啟用日期、責任人、放置位置、本次及下次計量檢定/校準、驗證日期等。其中，試驗中必不可缺的儀器設備是高壓滅菌器，工作壓力≥0.1MPa、容積≥30L壓力容器的操作人員必須取得特種設備作業人員資格證后方可進行操作[13-14]，試驗中所用的超凈工作臺應定期對沉降菌、氣流流速、潔凈度等進行檢測[15-16]，生物安全柜應定期檢測下降氣流流速、流入氣流流速等[17]。液氮罐需定期檢測液氮量，儲存培養基的冰箱和培養細菌、細胞的培養箱則應監測溫度，如果試驗實施過程中溫度波動超過允許范圍，應及時向專題負責人匯報，并評估對試驗的影響。此外，如果試驗中使用了菌落計數儀、細胞計數儀、細胞流式儀等，此類儀器還應定期進行性能驗證，確保性能符合要求。全自動菌落計數儀、細胞流式儀等計算機化系統管理應符合GLP要求，如需對用戶登錄、權限分配進行管理，確保登錄用戶的唯一性，系統應開啟稽查軌跡功能，生成的電子數據要定期備份，系統發生變更時需進行評估以確認是否需要進行驗證，系統退役時要有對原系統數據查閱與追溯的措施等[8，18]。
4.2 實驗材料
遺傳毒性試驗周期雖短，試驗涉及試劑卻種類繁多，Ames試驗需要瓊脂粉、牛肉膏、葡萄糖、L-組氨酸、D-生物素等試劑20余種[19-23]，體外細胞染色體畸變試驗需要細胞培養基、血清、秋水仙素、甲醇、乙酸等試劑也約20種[24-27]，幾乎都需要由不同成分試劑的組合才能配成最終所要的試劑，如Ames試驗中菌株鑒定用的組氨酸-生物素平板，是由瓊脂培養基、磷酸鹽貯備液/Vogel-Bonner(V-B)培養基E、葡萄糖、組氨酸、生物素等溶液按照比例組合而成，需要使用的試劑高達9種。而且，不同試劑的儲存條件和有效期也不盡相同，因此實驗室試劑的管理至關重要，應做好臺賬，定期清點儲存量和有效期，變質或過期的試劑及時處置。
遺傳毒性試驗耗材主要有槍頭、平皿、錐形瓶、離心管、玻片、燒杯、量筒等，且耗材中許多為遺傳試驗專用，如凍存管、細胞培養瓶等，因此要定期清點庫存，及時補充。
5、給藥制劑
5.1 受試物、溶劑對照品
受試物和溶劑對照品應有專人保管，其接收、登記、分發手續齊全并完整記錄。對于給藥時間超過4周的試驗，委托方提供的受試物和溶劑對照品應留樣歸檔，若為常規市售溶劑，如氯化鈉注射液、滅菌注射用水、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等，可根據機構制定的標準操作規程(standard operating procedure，SOP)中的要求確定是否需要留樣。因遺傳毒性體外試驗有其特殊性，給藥制劑配制時，溶劑一般首選水或DMSO，需注意的是，染毒過程中添加DMSO的量不宜過多，指導原則中未對其進行具體規定，可參考其他標準，如食品安全國家標準GB15193.4-2014《細菌回復突變試驗》中規定Ames試驗每平板DMSO原液的添加量不超過0.1mL[20]，GB15193.23-2014《體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗》中規定體外染色體畸變試驗DMSO濃度不應大于0.5%[25]，OECD TG473則規定一般不超過1%(v/v)[28]，其目的都是保證DMSO不對實驗系統產生毒性。除了上述水或DMSO以外的溶劑，均不應與受試物發生反應，且對菌株、細胞和哺乳動物肝臟微粒體酶(S9)沒有毒性和誘變性。配制后的給藥制劑不應對實驗系統造成污染，必要時可采取適當方法滅菌或除菌。DMSO為溶劑時，因DMSO有抑菌作用[29-30]，受試物與細胞、細菌接觸作用時一般情況下不會導致污染，建議通過預試驗確定是否有污染發生。
5.2 陽性對照品和麻精藥品
遺傳毒性試驗常會用到致突變劑，如環磷酰胺、絲裂霉素等，這些物質已明確能致突變，建議在保存過程中實行雙人雙鎖管理，雙人發放和領用，做到賬物相符。配制和使用過程中應穿戴好個人防護用品，如一次性無菌衣、手套、口罩、防護鏡等; 稱量陽性對照品的電子天平最好能做到專用，并要貼有醒目標識。使用完畢后，可按照食品安全國家標準或參考文獻，利用化學反應破壞這些物質中引起致突變作用的官能團，達到無害化處理[31-32]。此外，體內試驗動物實施安樂死時，會用到異氟烷、舒泰?50等獸用麻醉劑，應嚴格管理防控風險，其儲存和使用建議參考麻精藥品管理方法，使用完畢后可倒入脫脂棉等可吸收材料吸附暫存或大量稀釋后倒入廢液桶中，交由有資質的專業公司處理。
6、實驗系統
6.1 細菌
Ames試驗中，菌株為組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門菌和/或色氨酸營養缺陷型大腸埃希菌，至少應包含以下5種菌株的組合: TA98，TA100，TA1535; TA1537或TA97或TA97a，TA102或大腸埃希菌WP2uvrA或大腸埃希菌WP2uvrA(pKM101)。所用菌株應背景資料清楚，定期進行菌株鑒定，包括組氨酸/色氨酸缺陷型的鑒定、脂多糖屏障缺陷的鑒定(結晶紫敏感)、R因子的鑒定(抗氨芐青霉素)、四環素抗性的鑒定、uvrB修復缺陷型的鑒定(紫外線敏感)等，鑒定合格后可批量凍存備用。國內藥物Ames試驗使用較多的組合是TA97/TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535[33-39]，這些菌株生長均需組氨酸，均對結晶紫敏感，除TA1535外均具有氨芐青霉素抗性，除TA102外均對紫外線敏感并均無四環素抗性。
6.2 細胞
體外哺乳類細胞染色體畸變試驗，因中國倉鼠肺細胞(Chinese Hamster Lung Cells，CHL)對誘變劑敏感，易在體外建立細胞系，染色體數目較少且核型穩定，便于染色體分析，因此使用頻率較多[40-42]。Tk基因突變試驗通常采用L5178Y Tk+/--3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞。使用前，應對細胞支原體污染、核型等進行檢查。
培養時，先肉眼觀察培養液的顏色以及是否澄清，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態、有無污染，常見為細菌、霉菌和支原體污染，導致細胞生長緩慢或停止增殖直至死亡。其中細菌污染最易被發現，培養液短時間內會變渾濁，支原體污染則在培養初期不易被發現，可用熒光染色方法進行支原體檢查，熒光顯微鏡下觀察可見在細胞核外與細胞表面的熒光小點或絲狀點為支原體污染，也可用PCR檢測、支原體培養等方法檢測支原體[43-44]。可通過檢查細胞分裂中期的染色體進行核型分析，Lorge等[41]報道CHL細胞模態染色體數目為25條，L5178Y Tk+/--3.7.2C細胞模態染色體數目為40條。
6.3 大鼠/小鼠
體內動物試驗常用動物為大鼠和小鼠，動物抵達后應進行環境適應，個體標識清晰，群體飼養并提供適當的環境豐富物品，如磨牙棒、筑巢材料等[45-46]。動物的使用應關注動物福利，試驗方案實施前應獲得動物倫理委員會批準。
動物飼料、墊料應由合格供應商供應，并定期檢測，檢測頻率可由機構根據實際情況制定。飼料的質量檢測包含常規營養成分指標、化學污染物指標、微生物指標; 墊料檢測包括物理性指標、污染物指標、微生物指標; 飲用水檢測包括感官性狀、一般化學指標、微生物指標、毒理指標。飼料、墊料、飲用水的檢測報告應進行評估，飼料評估標準可參照國家標準GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養成分》、GB/T14924.2-2001《實驗動物配合飼料衛生標準》、GB/T18823-2010《飼料檢測結果判定的允許誤差》[47-49]，墊料評估標準可參照北京市地方標準DB11/T1126-2014《實驗動物墊料》、國家標準GB14925-2023《實驗動物環境及設施》等[12，50]，飲用水評估標準可參照國家標準GB5749-2022《生活飲用水衛生標準》、GB14925-2023《實驗動物環境及設施》的要求[12，51]。
7、實驗實施關鍵階段
目前藥物遺傳毒性評價試驗方法多采用細菌回復突變試驗、體外哺乳類細胞染色體畸變試驗、哺乳動物體內微核試驗的標準組合[33-39]。專題負責人要全面負責研究項目的實施和質量，研究相關的資料，如試驗方案、原始數據、標本、受試物和對照品留樣(如有)、總結報告以及與研究有關的其他文件、電子資料等，應及時歸檔且歸檔資料內容要完整。
7.1 細菌回復突變試驗
試驗實施過程中，應著重檢查菌株的接收、復蘇、傳代、凍存、鑒定，試劑配制、受試物配制、分析以及與細菌受試物作用、培養、菌落觀察計數等。
需要注意的是，指導原則中未明確要求與受試物作用前細菌的數量，OECD TG471以及化學品、食品、農藥、化妝品國家標準及規范中均要求加藥前細菌數達到109個·mL-1[19-22，52]，因此，每個實驗室均應建立本實驗室的菌株復蘇、培養、凍存等相關SOP，以確認培養基、培養溫度、培養時間等因素對細菌生長的影響。加藥時，受試物至少有5個劑量組，此外還有溶劑對照組和陽性對照組，這就需要底層和頂層培養基各210個，共需加樣525次，特殊情況下，還需設立更多的受試物劑量組和空白對照組，所以每個底層平皿均應有唯一的編號且標識清楚、準確，加樣過程要注意力集中，將菌液和受試物加入到頂層培養基試管中混勻后迅速倒入底層培養基平板上，倒入后要快速轉動平皿使之均勻分布，防止環境溫度低時，頂層在均勻分布前過早凝固。此外，還要注意整個加樣過程的無菌操作，防止污染。當試驗結果為陽性時，回復突變菌落數能達到數千，菌落通常密集難以每個計數，實驗室應建立此種情況計數方法的SOP。
7.2 體外哺乳類細胞染色體畸變試驗
試驗實施過程中，應著重檢查細胞株的接收、復蘇、傳代、凍存、核型檢查、支原體污染檢查記錄; 試劑配制、受試物配制、分析以及細胞與受試物作用、培養、細胞計數、染色體標本制備、染色與鏡檢等。
細胞染色體畸變試驗，從細胞復蘇、傳代、細胞毒性檢測到與受試物作用、收獲細胞，細胞要持續培養，因此污染的控制至關重要。制備染色體玻片是整個試驗的關鍵，收獲細胞后，需要進行離心、低滲、固定、滴片、染色等過程，每一步操作都要認真仔細、按要求操作，才能制備質量較好的玻片。最常見的影響鏡檢的因素是染色體的分散程度和染色，可從以下方面進行把控[53-54]: ①秋水仙素的劑量和作用時間。②低滲時間，時間過久則染色體破裂，過短則染色體不能分散。③固定，固定液應新鮮配制，先加少量固定液預固定，防止直接大量加入時凝結成塊。④滴片，所用玻片應干凈無油污，滴片前可用冰水浸泡，使得細胞懸液容易分散; 滴片時玻片傾斜放置，將細胞懸液滴在玻片不同位置以2滴為宜，輕吹使之擴散; 滴片高度要適中，太高染色體分散，太低則分散不好。⑤染色，磷酸鹽緩沖液的pH值應把握好，pH值過高染色體易染成藍色，影響閱片的舒適感，且染液最好用全新染液，避免重復利用使著色不好。此外，離心的速度與時間、混勻過程的力度、染色后浮色的沖洗等都會影響制片的質量。
7.3 哺乳動物體內微核試驗
試驗實施過程中，應著重檢查動物使用申請、接收、檢疫、飼養管理，試劑配制、受試物配制、分析以及動物分組、稱重、給藥、臨床觀察、安樂死、骨髓涂片制備、染色與鏡檢等。
動物給藥體積和速度可參考“A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood，Including Routes and Volumes”[55]，最大可能地保障實驗動物的福利。微核試驗中，常采用的是制備胸骨骨髓涂片，動物安樂死后[56]，按常規血涂片法涂片，長度約2~3cm，在空氣中晾干[57]，建議即使制備當日不染色，也將玻片標本置固定液中固定后保存[58]。使用吉姆薩染液染色時，嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈粉紅色/淡橘紅色[59-60]，染色過程中需要調好染色液的pH值，否則不易區分嗜多染紅細胞和正染紅細胞。除人工鏡檢方法外，在方法學被充分驗證后，也可采用流式細胞術檢測外周血微核或采用其他自動化分析系統對微核進行檢測。
8、質量保證(quality assurance，QA)檢查
QA對遺傳毒性試驗項目進行檢查，應制定每項研究項目的檢查計劃，檢查范圍要覆蓋項目的關鍵階段，檢查結果均應報告給機構負責人、專題負責人，對檢查發現問題要跟蹤檢查并核實整改結果。對原始數據和總結報告的審查，要審查試驗實施與試驗方案規定的一致性、總結報告信息與原始記錄的一致性以及總結報告是否包括所有偏離SOP和試驗方案的情況等，審查總結報告后，QA出具質量保證聲明，總結報告批準后如果有修改或補充，QA應重新審查并簽署質量保證聲明[61]。質量保證部門的檢查記錄及報告不屬于研究檔案，在SOP中應明確規定定期歸檔的具體時限及負責人員。
9、結語及討論
遺傳毒性試驗是采用細菌、哺乳動物細胞等測試受試物是否引起基因突變、染色體畸變、DNA損傷的試驗，這些試驗也包括整體動物試驗。檢測的遺傳終點分為基因突變、染色體畸變、DNA損傷，因遺傳終點的多樣化，通常不可能在單個實驗系統中檢測出多個終點，所以常用的科學方式是采用一組試驗。
《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》是進行藥物遺傳毒性試驗的基本原則，作為一個指導性文件，目的是為試驗組合和結果分析提供指導，未對試驗方法的具體操作細節進行詳細規定。在試驗設計上，應根據受試物特點，遵循“具體問題具體分析”原則，合理選擇試驗方法及設計試驗方案。2種組合中，標準組合一歷史應用經驗較多[2]，目前藥物評價采用較多的是組合一中的Ames試驗、體外染色體畸變試驗、體內微核試驗3種試驗組合，根據指導原則要求，體外試驗要根據受試物的溶解度和/或對實驗系統的毒性來確定高劑量組，且需要加入外源性代謝活化系統模擬體內代謝條件，在加和不加代謝活化系統的條件下進行，如果受試物有毒性作用，微核試驗高劑量組要有一定的毒性癥狀。各實驗室應建立菌株回變菌落數、染色體畸變率、微核率的歷史背景對照數據庫，以有助于確定統計學結果的生物學意義。
藥物遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分，必須執行《藥物非臨床研究質量管理規范》。近年來，在藥物GLP認證檢查中，也發現了遺傳毒性試驗相關的不符合GLP要求的問題，如原始記錄內容不完整、未規定配制后溶液的有效期、總結報告中信息錯誤等，這就要求試驗人員嚴格執行試驗方案和SOP，記錄試驗產生的所有數據，試驗中不能使用變質或過期的溶液，總結報告要真實反映原始數據，報告中各項信息應與原始記錄一致。此外，試驗中如果使用了機械計數器，其所產生的計數結果是用來計算微核率及染色體畸變率，雖然此儀器功能簡單，建議也需定期對此計數器計數的準確性進行確認。Ames試驗的試驗菌株的某些特性易丟失或變異，建議實驗室在SOP中確定長期保存的菌株定期鑒定的頻率。動物試驗中，機構應對飼料開封后的使用有效期進行驗證，對飼料、墊料和動物飲用水的檢測報告進行審核。總之，遺傳毒性試驗在試驗人員的資質、實驗系統、試驗實施的關鍵階段等有其特殊性，試驗實施應遵從“隨機、對照、重復”的基本原則，客觀評價受試物潛在的遺傳毒性，降低臨床用藥風險。相信隨著我國藥物研發水平及GLP認證的高質量發展，遺傳毒性試驗在實施細節方面也將不斷完善。
來源：《中國新藥雜志》 2024年 第33卷第14期
來源：凡默谷
