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背景 Background

《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》其中描述了遺傳毒性試驗方法有多種，根據試驗檢測的遺傳終點，可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據試驗系統，又可分為體內試驗和體外試驗。

目前于沒有任何單一試驗方法能檢測出所有的與腫瘤發生相關的遺傳毒性機制，因此，通常采用體外和體內試驗組合的方法，以全面評估受試物的遺傳毒性風險。[1]

其中推薦的兩種標準試驗組合，均提及到了細菌回復突變試驗，細菌回復突變試驗又稱Ames試驗（Bacterial Reverse Mutation Test)，是埃姆斯等人于1975年建立并不斷發展完善的用于檢測污染物致突變性的試驗[2]。

一般利用突變型鼠傷寒沙門氏菌株（TAl535、TAl538、TA98、TAl00、TAl537或TA97或TA97a）或大腸桿菌色氨酸缺陷型菌株（WP2 uvra/uvra[pKM101]/pKM101）并加入哺乳動物肝微粒體進行體外試驗，檢查其再次發生突變的情況用于檢測化合物的致變性和遺傳毒性。

表1.Ames菌株類型表

表2.沙門氏菌基因型的突變檢測[2]

原理

該試驗采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型菌株或大腸桿菌色氨酸缺陷型菌株，這些突變的菌株自身不能合成組氨酸或色氨酸，必須依賴外源性組氨酸/色氨酸才能生長，而在無組氨酸/色氨酸的選擇性培養基上不能存活。

假如有致突變物存在，致突變物可使菌株基因發生回復突變，由營養缺陷型轉化為野生型，使它在缺乏組氨酸/色氨酸的培養基上也能生長，據此判斷受試物是否為致突變物。原理如下圖1所示：

圖1.沙門氏菌致突變性的遺傳學評價方法[2]

試驗一般設計：平板制備

培養基

0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（L-組氨酸78mg，D-生物素122mg，加蒸餾水至1000mL）配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min，4℃保存。

頂層瓊脂培養基

取瓊脂粉1.2g、氯化鈉1.0g，加蒸餾水至200mL。配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。

Vogel-Bonner(V-B)培養基E

一水合枸椽酸100g、磷酸氫二鉀500g、四水合磷酸氫銨鈉175g、七水合硫酸鎂10g加蒸餾水至1000mL。配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

20%葡萄糖溶液

葡萄糖200g加蒸餾水至1000mL。配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。4℃保存

底層瓊脂培養基：

瓊脂粉7.5g、蒸餾水480mL、V-B培養基E10mL、20%葡萄糖溶液10mL。配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養箱中24h，備用總結就是把一個時間段的工作進行一次全面系統的總檢查、總評價、總分析、總研究，并分析成績的不足，從而得出引以為戒的經驗。

營養肉湯培養基

牛肉膏2.5g、胰胨5.0g、磷酸氫二鉀1.0g，加蒸餾水至500mL。配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

鹽溶液

氯化鉀61.5g、六水合氯化鎂40.7g，加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。4℃保存。

0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)2.965g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)29.015g，加蒸餾水至500mL。配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

S9混合液

肝S9100mL、鹽溶液20mL、滅菌蒸餾水380mL、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液500mL、輔酶II(NADP)4mmol、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mmol。配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現配并保存于冰水浴中。

表3.生物學特性鑒定

目前市面上有多種試劑盒用于Ames試驗，相比傳統的試驗，試劑盒在培養基成分準備、誘導S9制備、菌株鑒定、菌株培養等步驟能節約大量時間，試劑盒一般分平板摻入法和預培養平板摻入法，具體操作如下：

平板摻入法

a)準備所需底層培養基平皿若干。

b)融化頂層培養基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。

c)在保溫的頂層培養基中依次加入測試菌株菌液0.1mL，混勻；加受試物0.05mL~0.2mL（一般加入0.1mL。需活化時另外再加入10%S9反應混合液0.5mL），再混勻，然后迅速傾入底層培養基上。轉動平皿，使頂層培養基均勻分布在底層上，平放固化，37℃培養48h觀察結果。d)另做一陽性對照、溶劑對照和未處理對照。陽性對照不加受試物，只加標準誘變劑（即試劑盒陽性對照試劑，表4）；溶劑對照加除受試物和標準誘變劑以外的所有試劑，如溶DMSO等（光譜純或分析純）；未處理對照只在培養基上加菌液；其他方法同上。

預培養平板摻入法

預培養對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據情況確定是否進行預培養。在加入頂層瓊脂前，先進行以下預培養步驟：在試驗中，將受試物（需活化時另加入10%S9反應混合液）和菌液，在37℃中培養20min，或在30℃中培養30min，然后再加2mL頂層瓊脂，其他同上述平板摻入法。

表4.有和沒有 S9 代謝激活的陽性對照[2]

參考文獻

[1] 《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》，2018

[2]   Urvashi Vijay.Microbial Mutagenicity Assay: Ames Test ，Bio-protocol [J]Vol 8, Iss 06, Mar 20, 2018