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嘉峪檢測網 2025-03-10 20:17
摘 要： 建立了基于鈍化碳量子點的熒光分光光度法測定護膚品中的谷胱甘肽含量。高溫加熱檸檬酸制備碳量子點溶液，將不同濃度的谷胱甘肽標準溶液與1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺溶液（EDC）混合10 min，加入碳量子點溶液中反應10 min。樣品用水提取，經PBS磷酸鹽緩沖溶液稀釋后，與標準溶液進行同步操作，測定熒光強度。谷胱甘肽溶液的質量濃度在0.1～100 μg/mL范圍內呈線性關系，相關系數為0.999 4，方法檢出限為0.004%。在3種基質中，高、低兩種加標水平下的平均回收率為93.7%～101.5%，測定結果的相對標準偏差為1.3%～3.3%（n=6）。該方法操作簡便，適用于護膚品中谷胱甘肽含量的快速檢測。
關鍵詞： 熒光分光光度法； 護膚品； 谷胱甘肽
近年來，隨著消費者對健康重視程度的提升以及對護膚品成分關注度的增加，市場上對于多樣化、具有明確功效且見效迅速的護膚品需求日益增長，這一趨勢也逐漸成為護膚品研發的核心方向［1］。肽類是當前廣受關注的功能性成分。這類分子由蛋白質片段構成，通過脫水和聚合過程形成，并通過化學鍵（酰胺鍵）相互連接［2］。它們不僅具備調節生理狀態和營養作用的能力，還對人體生長發育周期、營養物質代謝、免疫調節機制以及內分泌平衡等方面發揮著至關重要的作用［3-5］。其中，谷胱甘肽是最早被應用于護膚品的天然活性分子之一。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三個氨基酸組成的三肽化合物，其結構內含特殊的活性基團，能夠有效地清除身體內部自由基，從而起到抵抗氧化、改善皮膚顏色、淡化色斑及減緩衰老等功效［6-7］。
目前，谷胱甘肽的檢測方法主要有液相色譜法［8-12］、液相色譜-串聯質譜法［13-14］、毛細管電泳法［15-16］、電化學法［17-18］、熒光法［19-22］等，其中色譜、質譜技術和熒光法應用較為廣泛。目前對護膚品中谷胱甘肽的檢測大多用色譜、質譜技術，其方法靈敏度較高，但對設備的要求也高。熒光法因其簡便的操作流程、低廉的儀器成本、快速的反應速度等優點，一直是科研和工業領域廣泛關注的分析技術，但熒光法對谷胱甘肽的檢測研究一般集中于生物樣本（如血清等），應用于護膚品的檢測還未見報道。研究［19］表明，高溫加熱檸檬酸得到的碳量子點通過1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的鈍化可提高其熒光強度。EDC分子被引入到碳量子點表面，促進了表面能級的陷阱發射，從而增強了碳量子點的熒光性能。通過預先將谷胱甘肽與EDC溶液混合，谷胱甘肽與EDC結合后消耗部分EDC，剩余的EDC繼續參與鈍化碳量子點，導致碳量子點的熒光強度發生改變。研究結果表明，谷胱甘肽的濃度與鈍化后碳量子點的熒光強度之間存在一定的線性關系，從而實現對谷胱甘肽的檢測。筆者結合護膚品的基質特點，首次應用該原理建立了熒光分光光度法測定護膚品中谷胱甘肽含量。該方法操作簡便，檢測成本低，為企業原料控制、保障消費者權益提供技術參考。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
熒光分光光度計：RF-6000型，日本島津公司。
電子分析天平： BSA224S型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。
旋渦振蕩器：Kylin-Bell VORTEX-5型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
高溫爐：BF51866C-1型，美國賽默飛世爾科技公司。
pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司。
高速離心機：3-18KS型，德國希格瑪實驗室離心機公司。
磁力攪拌器：MS7-H550-Pro型，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司。
檸檬酸：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）：純度（質量分數）為98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
PBS磷酸鹽緩沖溶液：0.01 mol/L，pH=7.0，上海源葉生物科技有限公司。
氫氧化鈉：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司。
EDC溶液：稱取適量EDC，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）溶解，配制成質量濃度為50 mg/mL的EDC溶液。
谷胱甘肽（還原型）標準物質：純度（質量分數）為99.9 %，上海安譜實驗科技股份有限公司。
實驗用水為一級水。
護膚品樣品：市售。
1.2 實驗步驟
1.2.1 碳量子點溶液的制備
稱取2.00 g（精確至0.01 g）檸檬酸于15 mL的帶蓋小燒杯中，將小燒杯放置在180 ℃高溫爐中加熱。40 min后，檸檬酸由固體變成淺黃色的液體，將小燒杯從高溫爐中取出，冷卻至室溫，此時小燒杯中的淺黃色液體凝固。向小燒杯中加入2 mL的100 mg/mL氫氧化鈉溶液，在磁力攪拌下完全溶解，再轉移至10 mL容量瓶中，用100 mg/mL氫氧化鈉溶液定容，搖勻，得pH值為7的碳量子點溶液，待用。
1.2.2 溶液配制
稱取谷胱甘肽標準物質50.0 mg于小燒杯中，加入PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）溶解并轉移至50 mL容量瓶中定容，混勻，制備成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液。準確移取適量體積的標準儲備溶液至10 mL容量瓶中，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）稀釋并定容，配制成質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL系列標準工作溶液。
1.2.3 樣品前處理
稱取護膚品樣品1.0 g（精確至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，加入4 mL水和1 g氯化鈉，在旋渦振蕩器上旋渦振蕩30 s，用水定容至標線，搖勻。4 000 r/min的條件下離心5 min。準確移取1.0 mL上清液至10 mL具塞比色管，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）定容至10 mL，搖勻，制備得樣品溶液。
1.2.4 上機檢測的前處理
準確移取5.0 mL PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）（對應F0）、5.0 mL不同濃度的標準工作溶液（對應F）、5.0 mL樣品溶液，各加入50 μL EDC溶液（50 mg/mL），在旋渦振蕩器上旋渦混勻10 min，各加入30 μL碳量子點溶液反應10 min，待測。
1.2.5 儀器工作條件
激發光波長為360 nm，激發與發射的狹縫寬度均為10 nm，掃描速度為2 000 nm/min，在380～600 nm的范圍內掃描記錄發射光譜。
1.2.6 標準曲線的建立
在1.2.5儀器工作條件下，記錄1.2.4中各溶液在發射波長460 nm處的熒光強度，未加入標準溶液時體系的熒光強度為F0，加入標準工作溶液后體系的熒光強度為F。以谷胱甘肽的質量濃度為橫坐標，F/F0為縱坐標，繪制標準工作曲線。
2. 結果與討論
2.1 反應時間的選擇
準確移取5.0 mL PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0），加入50 μL的50 mg/mL EDC溶液混勻，再加入30 μL碳量子點溶液，記錄不同反應時間的熒光強度見圖1。由圖1可知，前10 min內，熒光強度急劇升高；反應10 min后，體系的熒光強度基本平穩，說明EDC與碳量子點反應基本完成，所以選擇10 min為反應時間。
圖1 不同反應時間的熒光強度
Fig. 1 Effect of reaction time on fluorescence intensity
2.2 pH值的優化
考察不同pH值條件下對體系熒光強度的影響，結果見圖2。由圖2可知，當溶液pH值小于7時，熒光強度較小；當溶液pH值大于7時，熒光強度較大；在pH為7.0時，熒光強度最大，表明此時EDC對碳量子點的鈍化作用最強，因此選擇pH值為7.0為實驗的反應環境。為減小pH值波動給實驗帶來的影響，選擇pH值為7.0的PBS磷酸鹽緩沖溶液作為配制谷胱甘肽和EDC的溶劑，同時在樣品前處理時用pH值為7.0的PBS磷酸鹽緩沖溶液作為稀釋液。
圖2 不同pH值下的熒光強度
Fig. 2 Fluorescence intensity at different pH values
2.3 共存物試驗
考察護膚品中常見的共存物質L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-肌肽、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、角鯊烷、苯氧乙醇、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯和4-羥基苯甲酸丁酯對谷胱甘肽測定結果的影響，用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）將上述物質配制成質量濃度均為100 μg/mL的溶液，代替谷胱甘肽標準溶液按1.2.4和1.2.5步驟操作，不同共存物質下的F/F0值見圖3。由圖3可知，除谷胱甘肽之外，其他物質的F/F0值均接近1.0，表明只有谷胱甘肽能夠消耗掉EDC，間接影響碳量子點的鈍化程度，使碳量子點顯示出不同的熒光強度，說明該方法對于護膚品中谷胱甘肽的測定有較強的特異性。
1—空白；2—谷胱甘肽； 3—L-賴氨酸； 4—L-絲氨酸； 5—L-肌肽； 6—1，3-丙二醇； 7—1，2-丙二醇； 8—角鯊烷； 9—苯氧乙醇； 10—4-羥基苯甲酸甲酯； 11—4-羥基苯甲酸乙酯； 12—4-羥基苯甲酸丙酯； 13—4-羥基苯甲酸丁酯圖3 不同共存物質下的F/F0值
Fig. 3 F/F0 values under different coexisting substances
2.4 線性方程、檢出限和定量限
在1.2.5儀器工作條件下，按照1.2.6步驟建立標準工作曲線。體系加入不同濃度的谷胱甘肽后的熒光光譜圖見圖4。由圖4可知，體系在發射波長460 nm處的熒光強度隨谷胱甘肽濃度的增大逐漸減小，且最大發射峰位置相同，均位于460 nm，記錄460 nm處的熒光強度F。
圖4 體系檢測不同濃度谷胱甘肽的熒光光譜圖
Fig. 4 Fluorescence spectra of the system to detect different concentrations of glutathione
谷胱甘肽的質量濃度在0.1～100 μg/mL范圍內與F/F0呈線性關系，以谷胱甘肽的質量濃度為橫坐標（x）、F/F0為縱坐標（y）進行線性回歸，計算得線性方程為F/F0 = -0.004 3x+0.969 8，線性相關系數為0.999 4。其中F為不同濃度的谷胱甘肽與 EDC溶液（50 mg/mL）預混合反應后加入碳量子點的熒光強度，F0為不含谷胱甘肽的體系熒光強度。連續測定11次不加入谷胱甘肽時體系在460 nm處的熒光強度，以3倍標準偏差與線性回歸方程斜率的比值計算得檢出限為0.4 μg/mL。由于方法在測試樣品時稱取1 g樣品，經1.2.3前處理后，上機測試時相當于將樣品稀釋了100倍，因此方法檢出限為0.004%，以3倍的方法檢出限計算得方法定量限為0.012%。
2.5 加標回收試驗
分別選取水劑、膏霜和乳液3種代表性樣品進行回收率與精密度試驗。稱取不含谷胱甘肽的樣品，分別添加高、低兩個水平的標準溶液到樣品中，分別做6次平行試驗，回收率和測定值的相對標準偏差見表1。由表1可知，在三個濃度的加標水平下，谷胱甘肽的平均回收率為93.7%～101.5%，6次平行測定的相對標準偏差為1.3%～3.3%，表明該方法精密度、準確度均較高，可準確測定護膚品中的谷胱甘肽含量。
表1 陰性樣品加標回收試驗結果
Tab. 1 Negative sample spiking recovery test results
3. 結語
建立了基于鈍化碳量子點的熒光分光光度法測定護膚品中的谷胱甘肽含量。該方法線性范圍廣，精密度和準確度良好，分析速度快，檢測成本低，為護膚品中谷胱甘肽的檢測提供有力的參考依據，可增強企業原材料的質量管理和控制，確保消費者的合法權益得到有效保護。
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來源：化學分析計量
