二惡英是一類多氯代含氧三環(huán)芳烴類化合物的統(tǒng)稱，是高毒的持久性有機污染物，包括75種多氯代二苯并-對-二惡英(PCDDs)和135種多氯代二苯并呋喃(PCDD/Fs)。二惡英性質(zhì)非常穩(wěn)定，不易降解且極具富集性，通過空氣、水、泥土和植物及脂質(zhì)轉(zhuǎn)移富集于食物鏈中，積聚于動物和人的脂肪組織中，對生態(tài)環(huán)境、畜禽和人類健康造成危害。文中綜述了飼料中二惡英的主要污染來源及污染途徑，總結(jié)了飼料中二惡英類物質(zhì)的檢測方法，包括化學(xué)分析法、免疫學(xué)分析法和生物學(xué)分析方法。
二惡英通常是指具有相似結(jié)構(gòu)和理化特性的一組多氯取代的平面芳烴類化合物，屬氯代含氧三環(huán)芳烴類化合物，包括75種多氯代二苯并-對-二惡英 (PCDDs)和135種多氯代二苯并呋喃(PCDD/Fs)。這類物質(zhì)是燃燒和工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物，具有致癌性和環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用等多種毒性作用。二惡 英類化合物的物理化學(xué)特性相似，無色、無味，沸點與熔點較高，具有親脂性而不溶于水，在環(huán)境中穩(wěn)定性高，不易降解，在環(huán)境中可長期存在，并隨著環(huán)境轉(zhuǎn)移、 放大。二惡英在食物鏈中具有富集作用，人主要是通過食物攝入二惡英的，其次被二惡英污染的飼料對人類健康有潛在的危害。 1999年比利時發(fā)生因飼料污染而引起的二惡英嚴重中毒事件引起了全歐洲乃至世界人民的廣泛關(guān)注。近年來，我國加大了對食品及飼料中二惡英的監(jiān)控力度，建 立了一些二惡英的檢測機構(gòu)。了解二惡英的污染途徑，減少二惡英的暴露水平，建立飼料中二惡英的監(jiān)控機制、監(jiān)測方法和允許限量標(biāo)準(zhǔn)，加強對二惡英的檢測，以 保證飼料安全及動物源性食品的安全。
1 二惡英類化合物的的污染
1.1 二惡英的主要污染源
二惡英主要是含氯、碳、氫化合物燃燒 產(chǎn)生的，因此火山噴發(fā)和自然火災(zāi)等也會產(chǎn)生二惡英。從世界范圍來看，二惡英是人類活動過程中無意產(chǎn)生的“副產(chǎn)品”，如含氯工業(yè)產(chǎn)品殺蟲劑、防腐劑、殺菌 劑、除草劑、除蕎劑、防霉劑、氯代苯酚和油漆添加劑等工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，金屬冶煉、石油冶煉和氯堿工業(yè)也會產(chǎn)生二惡英類物質(zhì);城市垃圾和固體廢棄物的焚燒 產(chǎn)生的二惡英約占世界二惡英排放總量的37.7%，汽車尾氣和發(fā)電廠排放的廢氣也是二惡英的來源之一;制漿和造紙工業(yè)在使用氯氣進行漂白時會產(chǎn)生二惡英類 物質(zhì)，這些物質(zhì)會殘留在紙上或隨廢水排放到環(huán)境中。此外，還有人認為，光化學(xué)反應(yīng)和某些生化反應(yīng)也有可能產(chǎn)生二惡英類物質(zhì)。
1.2 二惡英的主要污染途徑
1.2.1 環(huán)境污染
火山爆發(fā)和自然森林火災(zāi)以及其它燃燒都會產(chǎn)生大量的二惡英排放到環(huán)境中，還有人認為辣根在酶 的催化作用下而發(fā)生的轉(zhuǎn)化以及各種微生物中所含的特種酶所產(chǎn)生的生原體氯化過程中也可能生成二惡英。然而環(huán)境中大部分的二惡英都是人為造成的。例如，在農(nóng) 業(yè)上大量使用農(nóng)藥、除草劑等含氯化學(xué)品，把含有二惡英或被二惡英污染的殘渣倒入土地中或把秸稈等就地焚燒，城市垃圾和塑料袋類固體廢棄物的焚燒，生活中油 漆添加劑、粘合劑、潤滑劑、膠粘劑、增塑劑等的使用，紙漿、紡織品漂白后排放的廢水，汽車尾氣、金屬冶煉和煤電廠的廢氣等，這些都會對環(huán)境造成污染，并且 二惡英還可以吸附在顆粒上，通過水、空氣、土壤等把污染擴大到整個生態(tài)系統(tǒng)中。二惡英化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，一旦生成可能存在幾十年。二惡英是脂溶性化合物， 容易在含脂肪較高的動物食品中富集，可以通過食物鏈積聚到人和畜禽體內(nèi)，危害人畜的健康。
1.2.2 飼料污染
飼料中的二惡英主要來 源于被污染的飼料原料、飼料加工、運輸和貯存過程及一些潤滑油泄露和人為污染。
二惡英通過空氣、水、土壤直接沉積到飼料作物的表面上，對玉米、小 麥、高梁、大麥、大豆等飼料作物造成污染。如用造紙廠污水灌溉的作物、附近金屬冶煉和煤電廠的廢氣污染等，也可以通過農(nóng)藥、除草劑等聚積到作物體內(nèi)。此 外，飼料原料中如果使用了被二惡英污染的飼用油脂及油脂加工的副產(chǎn)物，如用浸提法加工的豆粕、棉粕、菜籽餅、花生餅等也會對飼料造成污染。為預(yù)防和避免二 惡英對飼料的污染，在選用飼料原料時，應(yīng)不使用含有二惡英的飼料原料。
二惡英具有極強的親脂性，極易積聚于油脂中，在飼料原料如飼用油脂加工中使 用的溶劑、油脂的加工方式等不當(dāng)都會污染飼料原料。1969年，美國用含二惡英的五氯酚處理生皮后提取的肥油飼喂雛雞引起了“雛雞浮腳病”，造成上萬只雛 雞死亡。因此在飼料原料(尤其是動物源性飼料原料)的加工過程中應(yīng)嚴格按科學(xué)的工藝要求生產(chǎn)， 避免生產(chǎn)過程中產(chǎn)生二惡英。
在飼料運輸和貯存過程 中，避免接觸到被污染的表面，包括被二惡英污染的飼料、車皮和盛裝飼料的容器等。如用被污染的飼料袋(尤其是聚氯乙烯袋)裝飼料時就會將二惡英轉(zhuǎn)移至飼料 中。
避免一些潤滑油泄露和人為污染，如1968 年日本發(fā)生的米糠油事件就是由潤滑油泄漏引起的, 造成幾十萬只雞死亡和幾千人中毒的嚴重后果。現(xiàn)在，由于利益的驅(qū)使，使得一些不法分子專門收集飯店周圍的陰溝飯菜，將飯菜中的垃圾油重新煉制，這種“地溝 油”通常富含二惡英，如果飼料中添加此油，導(dǎo)致飼料被污染。
2 飼料中二惡英的檢測
二惡英的分析屬于多組分、超痕量分析，對樣品的采集、 定量提取和凈化技術(shù)要求很高。目前飼料中二惡英的主要分析方法有化學(xué)分析法、免疫學(xué)分析法和生物檢測法。
2.1 化學(xué)分析法
二惡英的化學(xué) 檢測方法有很多，被人們普遍認同的是高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HRGC-HRMS)方法，稱為二惡英檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該法的缺點是儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù) 雜、昂貴耗時，不能滿足大量檢測的需要。全面的二維空間GC×GC-μECD技術(shù)已經(jīng)被試驗，該方法很可靠，在檢測能力、可重復(fù)性、再現(xiàn)性和精確度方面， 該法和GC-HRMS的結(jié)果保持一致。對于我國等發(fā)展中國家來說，由于經(jīng)濟實力有限，所以二惡英的檢測水平非常落后，由此，出現(xiàn)了新的二惡英的化學(xué)檢測 法。氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)法簡化了HRGC-HRMS法中的很多步驟，選擇性地使用內(nèi)標(biāo)物，有一定的發(fā) 展前景。樣品中二惡英的含量很低，在檢測過程中實際樣品中基質(zhì)和其它干擾物的濃度大大高于目標(biāo)化合物，因此樣品前處理的結(jié)果在很大程度上影響著分析結(jié)果的 準(zhǔn)確性。二惡英的化學(xué)檢測方法幾乎應(yīng)用了所有樣品前處理技術(shù)，除傳統(tǒng)的索氏提取方法、超聲萃取、液液萃取等技術(shù)應(yīng)用外，微波輔助萃取、加速溶劑萃取 (ASE)、二氧化碳超臨界萃取法(SFE)和固相萃取等樣品提取技術(shù)也在二惡英的分析中得到驗證和應(yīng)用。根據(jù)樣品的類型，選擇適當(dāng)?shù)膬艋椒ǎ行У亟?低共提物中的干擾組分。傳統(tǒng)的凈化技術(shù)包括玻璃柱色譜的洗脫和其它化學(xué)方法，耗時長、溶劑用量大，近年來研制的自動化前處理設(shè)備如自動凝膠凈化裝置、全自 動樣品凈化裝置等在食品中二惡英的分析已經(jīng)十分廣泛。適合于脂肪含量高的生物樣品的半透膜濾過凈化技術(shù)受到越來越多人的關(guān)注，原因是該凈化技術(shù)經(jīng)濟、高 效。親和色譜和聚酰胺色譜分離方法的凈化除雜效果不錯，但仍需進一步改善。用二惡英的前體或衍生物替代二惡英的間接檢測方法尚處于研究階段，還沒有實際應(yīng) 用。
2.2 免疫學(xué)和生物學(xué)檢測法
由于化學(xué)分析法分離凈化繁雜，對儀器設(shè)備及實驗人員要求極高，在一般實驗室很難開展。隨著科技發(fā)展，生 物法測定二惡英的研究成為熱點，一些實驗室建立了免疫法和各種生物檢測方法(BDMs)。免疫法的原理是二惡英可被受體特異性識別并結(jié)合，而生物檢測法是 二惡英能在體外細胞內(nèi)培養(yǎng)中轉(zhuǎn)化為特殊生物信號。與化學(xué)分析法相比，這兩種方法具有快速、簡便、靈敏度高、耗時少、費用低，而且操作也比較簡單的優(yōu)點，當(dāng) 然這兩種方法也有弊端，如免疫法的缺點是不能檢測所有異構(gòu)體且難找到抗體，生物法的缺點是不能分別檢測二惡英的同系物等。生物法主要是用于大量樣品的篩選 和快速半定量檢測。
2.2.1 酶免疫分析(EIA)法
競爭性EIA法是特異性的針對2,3,7,8-TCDD，根據(jù)老鼠或兔子單克隆或 多克隆抗體(DD3)與二惡英結(jié)合建立競爭抑制酶免疫方法。由于單克隆抗體和多克隆抗體的EIA技術(shù)選擇性和靈敏度都較低，Harrison等發(fā)展了靈敏 度較高的微板和試管技術(shù)。使用酶競爭配合物(HRP)和二惡英共同競爭有限的DD3抗體的特異性結(jié)合位點，以一系列不同濃度的2,3,7,8-TCDD為 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，做出2,3,7,8-TCDD標(biāo)樣與對應(yīng)樣品的劑量-效應(yīng)曲線，樣品中二惡英毒性強度以計算出的TCDD毒性等價濃度間接表示。最終通過測定 DD3與酶競爭配合物的熒光強度來得到二惡英的TEQ, HRP的熒光強度與二惡英的TEQ成反比。該法操作簡單、快速、準(zhǔn)確性高，是飼料中二惡英檢測的快速、有效的方法之一。另外，Yudio等對一種新的酶聯(lián) 免疫吸附技術(shù)進行了報道，其選擇TMDD代替TCDD，結(jié)果較另人滿意。
2.2.2 時間分辨熒光免疫分析(DEIFIA)法
DEIFIA 法是目前最新的一種免疫學(xué)方法。該方法利用生物基因技術(shù)選擇出合適的抗原鍵合銪離子，與樣品中二惡英競爭單克隆抗體，待免疫反應(yīng)完全后加入熒光增強液，使 銪離子從抗原中解離下來，進入增強液，形成膠束，高效地發(fā)出熒光。鰲合物用時間分辨熒光法分析，其熒光強度與二惡英的TEQ成反比，以此獲得待測樣本中二 惡英的TEQ值。該法的靈敏度高，用樣量少，檢測成本低。
2.2.3 化學(xué)激活熒光表達(CALUX)法
CALUX法是一種新的靈敏度最 高的二惡英檢測方法，是唯一得到(美)環(huán)保局(EPA)推薦使用的二惡英分子生物學(xué)檢測方法，有很高的使用價值和廣闊的應(yīng)用前景。此法是將螢火蟲熒光素酶 基因作為報告基因結(jié)合到控制轉(zhuǎn)錄的DRE上，制備成質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染H4ⅡE大白鼠肝癌細胞系，以此構(gòu)成CALUX系統(tǒng)熒光素酶誘導(dǎo)活性與二惡英的毒性系 數(shù)相對應(yīng)。而且該系統(tǒng)合成的熒光素量和熒光強度與加入的二惡英類物質(zhì)的量成正比，最終測得二惡英的量。該法與傳統(tǒng)的生物學(xué)法相比，操作更加簡單，分析成本 也更低，MURK已用該法檢測水體和血漿中的二惡英，效果良好。
2.2.4 化學(xué)激活熒光基因表達(CAFLUX)法
CAFLUX法是將 增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為報告基因，采用Hepalclc7作為反應(yīng)細胞株進行檢測的生物檢測方法。CAFLUX法可應(yīng)用于高通量檢測，比 CALUX法更快速、經(jīng)濟、簡便，還可以對細胞進行“實時”監(jiān)測。在飼料和食品二惡英檢測中，CAFLUX法的發(fā)展空間很大，技術(shù)也較成熟。該方法的缺點 是如果增強綠色熒光蛋白過于穩(wěn)定將影響細胞的背景熒光值，使其偏大。
2.2.5 7-乙氧基異吩惡唑酮-脫乙基酶(EROD)法
EROD 法是最早建立的生物檢測方法。EROD法在一定濃度范圍內(nèi)具有線性劑量效應(yīng)關(guān)系，在該線性范圍內(nèi)可準(zhǔn)確測定二惡英的量。EROD法快速、重復(fù)性好、細胞株 和相關(guān)試劑比較易得，不足的是其可靠性和靈敏度沒有CALUX法高。另外，該法測得的TEQ值比化學(xué)分析法所得的值要高幾倍。迄今為止，報道該法的文獻較 多，但用EROD法測定飼料中二惡英的報道卻很少。
2.2.6 PCR技術(shù)
二惡英特異地結(jié)合芳香烴受體(AhR)，然后再與一段特殊 DNA(DRE)結(jié)合，除去未結(jié)合的二惡英應(yīng)答元件(DRE)，擴增剩下的結(jié)合DRE，最后用實時PCR檢測，由于該技術(shù)要求在飼料中二惡英檢測時具有有 效靈敏度和可靠性，所以目前還不能普遍應(yīng)用。
2.2.7 蛋白標(biāo)記分析
蛋白標(biāo)記的研究是把酶(如過氧化物岐化酶)、應(yīng)激蛋白(如 hsp60)、受體或cytosketal蛋白(如肌漿球蛋白)和二惡英類物質(zhì)建立關(guān)系，通過標(biāo)記蛋白檢測二惡英。AhR-DNA 結(jié)合的凝膠阻滯電泳生物檢測法(GRAB)就是利用凝膠阻滯電泳分離配體-AhR-DNA復(fù)合物，并通過同位素標(biāo)記的DNA來測定復(fù)合物的含量。該法操作 簡單、迅速，但費時，有放射性污染，并且檢測限和靈敏度都較低。
3 小結(jié)
二惡英類污染物進入環(huán)境和飼料后，不容易被分解，長期殘留在環(huán)境 和飼料中，并隨生物鏈進入到動物機體，危害動物及人類的健康。因此對二惡英的監(jiān)測是長期的任務(wù)，雖然國內(nèi)已有少數(shù) HRGC-HRMS二惡英檢測實驗室，但其檢測能力十分有限，只能檢測少數(shù)幾種二惡英類物質(zhì)，遠遠不能滿足對二惡英的監(jiān)測監(jiān)控需要。建立快速、經(jīng)濟的生物 檢測法對飼料中二惡英進行定量篩選、常規(guī)檢測和定性分析，解決二惡英對我國飼料可能造成的污染是關(guān)系到飼料安全及食品安全的重要問題，應(yīng)引起足夠重視。
