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嘉峪檢測網 2019-05-28 15:06
本文通過對分析方法驗證中的線性可接受標準進行深度剖析，以便大家理解各指導原則或指南所推薦的相關要求。只有透過現象看本質，不拘泥于指南要求，才能制定符合其既定用途的可接受標準，如線性相關系數可接受標準制定為不小于0.99還是不小于0.999；有關物質的線性截距制定為不得過25%，是否可以滿足測定要求；剩余標準偏差有沒有必要統計。
1.分析方法驗證線性概述
線性系指在設計的范圍內，測定響應值與試樣中被測物濃度呈比例關系的程度。2015版《中國藥典》通則<9101>中規定應列出回歸方程、相關系數和線性圖。USP<1225>規定應提交其相關系數、Y軸截距、回歸線斜率、殘留平方和。2010版實驗室控制系統GMP實施指南要求，需統計相關系數、截距、剩余標準偏差。
2.名詞解釋
相關系數(R)：相關系數是解釋變量與總變異之比，也可以說成是y的樣本變異中被x解釋的部分，占比越大解釋的就越多。
假設總平方和SST不為零（除非所有y都相等這樣一個極端的情況），可以得到相關系數：
SSE:解釋平方和、SST:總平方和、SSR:殘差平方和、R2線性相關系數。
殘留平方和（SSR）：為了明確解釋變量和隨機誤差各產生的效應是多少，統計學上把數據點與它在回歸線上相應位置的差異稱殘差，把每個殘差的平方和稱為殘差平方和，它表示隨機誤差的效應。
截距：一般是指在Y軸上的截距，即直線和Y軸的交點縱坐標。
剩余標準偏差（SE）：也稱均方差，統計學概念，在線性回歸分析中，真實值和估計值之間的差成為殘差(或者剩余量)，所有預測值的殘差平方和(或者剩余平方和)，剩余標準偏差就是剩余平方和的開平方，用來表示估計值的精度。EXCEL表中可采用STEYX進行計算。
3.線性相關系數的意義及控制方式
線性通過最小二乘法進行曲線擬合，其相關系數是評估一元回歸線是否有意義，通常用R表示。
計算公式為
1、當所有的Yi值都在回歸線上時，R=1
2、當y與x之間不存在直線關系時，R=0
3、當R的絕對值在0與1之間時，可根據測量的次數及置信水平與相應的相關系數臨界值比較，絕對值大于臨界值時，則認可這種線性關系是有意義的。
相關系數的臨界值表（部分）
若測定次數為5，則f=5-2=3，R≥ 0.991說明該線性的置信度為99.9%。
舉例：若R為0.990，說明變量Y的變異中有99.0%是由變量x引起的，該參數屬于是概率評估。
實際上只要滿足n=5，R≥ 0.991則線性的置信度（99.9%）完全滿足線性相關性要求。若非要體現不同方法的差異性控制。可按下述思路考慮：
目前線性均是采用對照品儲備液逐級稀釋進行，線性相關性主要取決于：
1、測定原理；
2、檢測過程偏差（樣品的配制過程產生的偏差及儀器的進樣精度）；
3、質量標準中的限度要求。
基于以上三點，線性相關系數可按下表制定可接受標準：
案例01-1
案例01-2
4.線性截距的意義及控制方式
以雜質線性截距為例進行說明。
化藥雜質控制一般采用外標一點法進行，即默認線性通過原點，需評估線性偏離對測定結果的影響，Y軸截距的絕對值應在標準響應值的25%以內。
為什么是25%？
USP<621>system suitability-271頁計算公式是對含量測定范圍與系統適用性相關要求進行說明，相關要求不適用于有關物質控制。
但“RSD”與“限度范圍要求”的相關性的計算公式，我們可以引申一下，RSD%=KB ?n/t90%,n-1，RSD為相對標準偏差，K為常數0.349，B為各論中給出的上限減去100%（引申為含量的范圍要求），n為參考溶液重復進樣的次數（3 ≤n ≤6），t90%是在n-1自由度90%的概率下的一組t值。
相對標準偏差要求
根據公式，若B為30%（即雜質回收率范圍為70%-130%），則進樣6次允許的最大RSD為12.7%。假設線性從限度濃度50%做到150%且50%、150%的點相對均值的波動幅度為12.7%，則Y軸截距的絕對值約為100%響應值的25%。如下所示：
案例02：截距在20%-25%之間，回收率范圍對應為70%-130%
線性截距可接受標準的制定：
5. 線性剩余標準偏差的意義及控制方式
線性的剩余標準偏差也稱均方差，統計學概念，在線性回歸分析中，真實值和估計值之間的差成為殘差(或者剩余量)，所有預測值的殘差平方和(或者剩余平方和)，剩余標準偏差就是剩余平方和的開平方，用來表示估計值的精度。EXCEL表中可采用STEYX進行計算，該參數統計的意義：
每一個樣品濃度x對應有一個y值，根據正態分布原理，y=a+bx線性方程，其中：
68.3%置信區間為y=a+bx±SE
95.4%置信區間為y=a+bx±2SE
99.7%置信區間為y= a+bx±3SE
案例 03
6.關于線性響應因子的標準偏差及控制方式
該指標用于評估測定系統偏差（人員及設備引入），以RSD表示：
案例04
7.關于線性是進單針還是雙針
若是手動進樣，為減少進樣差異，一般進雙針（取均值進行線性統計），現在均是自動進樣，進樣精度大大提高，故單樣單針即可。
參照文獻
[1]《中國藥典》通則<9101>
[2]USP<1225>
[3]USP<621>
[4]2010版實驗室控制系統GMP實施指南
來源：藥事縱橫
