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嘉峪檢測網 2019-08-30 08:34
器審中心于2019年8月27日，發布美國賽沛公司的《甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 聯合檢測試劑盒（實時熒光 PCR 法）》技術審評報告。從這份報告中，我們可以了解甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 聯合檢測試劑盒（實時熒光 PCR 法）在研發階段需要做哪些檢測實驗。
醫療器械產品注冊技術審評報告
基本信息
產 品 中 文 名 稱 ：甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 聯合檢測試劑盒（實時熒光 PCR 法）
產品英文（原文）名稱：Xpert Xpress Flu/RSV Assay
產 品 管 理 類 別 ：三類
申請人名稱 ：美國賽沛公司 Cepheid
臨床前研究摘要：
（一）主要原材料
本產品的主要原材料包括：引物和探針、DNA Taq 酶、逆轉 錄酶和 dNTPs。引物和探針由申請人設計并生產，其他主要原材 料均購自外部供應商。各主要原材料均通過質量標準并檢驗合 格。
試劑盒在企業內部產品放行之前使用企業參考品進行最終 放行檢測。陰性參考品中含有其他病原體，對試劑盒的特異性
進行質控；陽性參考品中含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，使用時稀釋至指定濃度后再進行確認檢測， 試劑盒檢測結果符合質控標準后才可放行使用。
試劑盒包含樣本處理質控（SPC）作為內部質控。SPC 用于 驗證流感病毒和 RSV 是否能正確釋放 RNA，從而確保樣本處理 過程的正確性，同時可以監測 RT-PCR 和 PCR 反應中與樣本相 關抑制作用。
（二）生產工藝及反應體系研究
申請人通過對試劑主要生產工藝的研究，確定了最佳生產 工藝。
申請人對反應體系中的引物和探針濃度、DNA Taq 酶、逆轉 錄酶、離子和 dNTPs、加樣體積以及 PCR 反應體系條件等進行篩 選和優化，并通過驗證最終確定了最佳反應體系。
（三）分析性能評估
本產品分析性能評估內容主要包括：最低檢出限、分析特 異性、分析反應性、干擾物質、攜帶污染、重復性等。
在最低檢測限研究中，申報產品對兩種甲型 H3N2 流感毒株、 兩種甲型 2009 H1N1 流感毒株、兩種乙型流感毒株、兩種呼吸 道合胞病毒 A（RSV A）毒株和兩種呼吸道合胞病毒 B（RSV B） 毒株進行檢測并得到各毒株的 LoD 值如下：
|
病毒株 |
LoD（TCID50/mL） |
|
Influenza A/California/7/2009 |
0.02 |
|
Influenza A/Florida/27/2011 |
0.04 |
|
Influenza A/Perth/16/2009 |
0.01 |
|
Influenza A/Victoria/361/2011 |
0.75 |
|
Influenza B/Mass/2/2012 |
0.40 |
|
Influenza B/Wisconsin/01/2011 |
0.19 |
|
RSV A/2/Australia/61 |
0.87 |
|
RSV A/Long/MD/56 |
1.10 |
|
RSV B/Wash/18537/62 |
0.79 |
|
RSV B/9320/MA/77 |
2.30 |
在分析特異性研究中，檢測 44 種代表常見呼吸道病原體或鼻咽中可能存在的病原體培養基來評價 Xpert Xpress Flu/RSV Assay 的分析特異性，分析特異性為 100%。各菌株及其濃度見 下表：
|
微生物 |
濃度 |
|
腺病毒 1 型 |
1.12E+06 TCID50/mL |
|
腺病毒 7 型 |
1.87E+05 TCID50/mL |
|
人冠狀病毒 OC43 |
2.85E+05 TCID50/mL |
|
人冠狀病毒 229E |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
巨細胞病毒 |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
埃可病毒 |
3.31E+07 TCID50/mL |
|
腸病毒 |
3.55E+05 TCID50/mL |
|
EB 病毒 |
7.16E+07 TCID50/mL |
|
單純皰疹病毒 |
8.90E+05 TCID50/mL |
|
麻疹病毒 |
6.31E+05 TCID50/mL |
|
人類偏肺病毒 |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
流行性腮腺炎病毒 |
6.31E+06 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 1 型 |
1.15E+06 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 2 型 |
6.31E+05 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 3 型 |
3.55E+06 TCID50/mL |
|
鼻病毒 1A 型 |
1.26E+05 TCID50/mL |
|
鮑氏不動桿菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
洋蔥伯克霍爾德菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
白色念珠菌 |
3.20E+06 CFU/mL |
|
近平滑念珠菌 |
3.00E+06 CFU/mL |
|
百日咳桿菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
肺炎衣原體 |
1.00E+05 CFU/mL |
|
弗氏檸檬酸桿菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
棒狀桿菌屬 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
大腸埃希菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
糞腸球菌 |
1.30E+06 CFU/mL |
|
流感嗜血桿菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
羅伊氏乳桿菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
軍團菌屬 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
卡他莫拉菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
結核分枝桿菌（無毒性） |
1.00E+06 CFU/mL |
|
肺炎支原體 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
腦膜炎奈瑟球菌 |
2.15E+06 CFU/mL |
|
粘液奈瑟球菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
痤瘡丙酸桿菌 |
2.40E+07 CFU/mL |
|
銅綠假單胞菌 |
3.70E+06 |
CFU/mL |
|
金黃色葡萄球菌 （產蛋白 A） |
2.20E+06 |
CFU/mL |
|
表皮葡萄球菌 |
3.40E+06 |
CFU/mL |
|
溶血葡萄球菌 |
4.00E+06 |
CFU/mL |
|
無乳鏈球菌 |
3.50E+06 |
CFU/mL |
|
肺炎鏈球菌 |
1.00E+06 |
CFU/mL |
|
釀膿鏈球菌 |
1.00E+07 |
CFU/mL |
|
唾液鏈球菌 |
1.00E+07 |
CFU/mL |
|
血鏈球菌 |
3.10E+06 |
CFU/mL |
在干擾物質研究中，對鼻咽中潛在的干擾物質進行了研究， 主要有血液、鼻腔分泌物或粘液、鼻和咽喉中用于緩解鼻塞、 鼻腔干燥、刺激或哮喘和過敏癥狀的藥物，以及抗生素和抗病 毒藥物等，其濃度詳見下表。
|
物質／分類 |
檢測濃度 |
|
β腎上腺素支氣管擴張劑 |
0.83 mg/mL（即 1 劑／天） |
|
血液 |
2% (v/v) |
|
BD™Universal Viral Transport System |
100% (v/v) |
|
Remel M4® |
100% (v/v) |
|
Remel M4RT® |
100% (v/v) |
|
Remel M5® |
100% (v/v) |
|
Remel M6® |
100% (v/v) |
|
咽喉含片、口服麻醉藥和鎮痛 藥 |
1.7 mg/mL |
|
粘蛋白 |
2.5% (w/v) |
|
抗生素，鼻用軟膏 |
10 mg/mL |
|
生理鹽水鼻噴霧劑 |
15% (v/v) |
|
Anefrin 鼻噴霧劑 |
15% (v/v) |
|
PHNY 滴鼻劑 |
15% (v/v) |
|
達菲，抗病毒藥 |
7.5 mg/mL |
|
抗菌藥，全身性 |
4µg/mL |
|
Zicam 鼻用凝膠 |
15% (w/v) |
|
鼻用皮質類固醇 |
5µg/mL |
在本研究的檢測濃度下，所有物質均未對檢測試劑盒檢測結果造成干擾。
在攜帶污染研究中，使用相同的 GeneXpert 模塊檢測陰性 樣本后立即檢測加有極高水平甲型流感樣本或極高水平 RSV A 樣本的模擬基質。該研究顯示一次性使用、單獨包裝的檢測盒 可避免在同一模塊檢測陰性樣本后對極高水平陽性樣本的攜帶 污染。
在重復性實驗中，申請人采用三批成品試劑盒，通過對陰性樣本、Flu A 低水平陽性、Flu A 中等水平陽性、Flu B 低水 平陽性、Flu B 中等水平陽性、RSV 低水平陽性和 RSV 中等陽性 樣本的檢測，評估了試劑盒的重復性。同時，一項多中心的研 究檢測了包括一份陰性質控品和濃度為其 LoD 1 倍（低水平陽 性）和 2-3 倍（中等水平陽性）的甲型流感、乙型流感或 RSV 的模擬基質各兩份，評估了批內/批間、日內/日間、研究中心 間以及不同操作者之間的精密度。結果顯示試劑盒在儀器間、 批內/批間、日內/日間、研究中心間無統計學顯著差異。
（四）陽性判斷值或參考區間研究
申請人通過臨床前研究確定陽性判斷值，并經臨床研究采 用臨床樣本驗證陽性判斷值。臨床前數據來源于一項臨床前研 究，使用該試劑盒與對比方法進行比對試驗，分別檢測一定例 數的樣本，通過研究二者的陽性符合率（PPA）和陰性符合率（NPA），以及真陽性結果的分布和頻率等最終得出，試劑盒對 于 Flu A（Flu A 1 和 Flu A 2）、Flu B 和 RSV 的陽性判斷值 為 Ct=40。
臨床研究共收集了 2580 份受試者樣本，其中 2167 份納入 最終統計。相對于參考試劑盒, 本試劑盒檢測 Flu A 的 PPA、NPA 和總體百分比一致性（OPA）分別為 98.2%、98.0%和 98.0%。試劑盒檢測 Flu B 的 PPA、NPA 和 OPA 分別為 100%、98.5%和98.6 %。試劑盒檢測 RSV 的 PPA、NPA 和 OPA 分別為 99.0%、98.6%和 98.7%。綜合以上研究確認，本產品的陽性判斷標準為 Ct 值小于或等于 40 時為陽性，Ct 大于 40 時為陰性。
（五）穩定性研究
申請人對本產品的穩定性進行了研究，確定了在各種條件 下本產品的有效保存時間。在 2℃、28℃、35℃、45℃和 50℃ 下隨時間監測三批試劑盒的性能。在不同時間點分別使用試劑 盒檢測陰性、低水平陽性和高水平陽性樣本，每批收集了 19 個 月的陽性和陰性樣本實時數據。結果顯示在 2～28℃下，試劑盒 有效期為 18 個月。
樣本穩定性研究：將陰性和陽性樣本儲存于不同溫度下， 在不同的時間點進行檢測，研究表明鼻咽拭子樣本在使用試劑 盒進行檢測前，可儲存于室溫（15～30℃）下達 24 小時和冷藏
（2～8℃）溫度下儲存達 7 天。
來源：國家藥品監督管理局
