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從藥物研制到開(kāi)發(fā)、制造和QA/QC，分析型的液相色譜在藥物的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著重要作用，使得使用者能夠迅速進(jìn)行篩選、純化的分析工作。現(xiàn)在市面上廣泛使用的分析型高效液相色譜主要包括：流動(dòng)相模塊，在線脫氣模塊，動(dòng)力模塊（泵），進(jìn)樣模塊，柱溫箱模塊，檢測(cè)器模塊等。以下我們將詳細(xì)討論其中流動(dòng)相模塊、動(dòng)力模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器模塊、柱溫箱模塊的使用注意事項(xiàng)，而這些模塊往往也是影響檢測(cè)結(jié)果的重要模塊，打算將在實(shí)驗(yàn)室中平時(shí)總結(jié)的注意事項(xiàng)加以交流。

高效液相色譜模塊示意圖

1、流動(dòng)相模塊

流動(dòng)相就如同人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行與否。在日常使用中避免使用可腐蝕鋼的溶劑：堿金屬鹵化物及其酸溶液(如：碘化鋰、氯化鉀等)；高濃度無(wú)機(jī)酸，如硝酸、硫酸；可能含有過(guò)氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)，這些在使用前利用干燥氧化鋁的穩(wěn)定性來(lái)鈍化處理過(guò)氧化物，在過(guò)氧化物外面形成一個(gè)包裹層；四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液，它們不但容易形成過(guò)氧化物而且它們會(huì)腐蝕一些Peek（聚醚醚酮材料，Polyetherketone）材料的液相色譜配件。流動(dòng)相可以使用超純水、磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺、離子對(duì)試劑、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、乙酸、乙酸胺、丙酮、異丙醇、氨水等。

流動(dòng)相中的過(guò)濾器

在每瓶流動(dòng)相中配有過(guò)濾器，應(yīng)定期檢查溶劑過(guò)濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)，定期清洗溶劑過(guò)濾器及溶劑瓶，每三個(gè)月至少清洗一次。對(duì)于以下幾點(diǎn)流動(dòng)相部分的注意事項(xiàng)更是在每次使用都應(yīng)當(dāng)注意的。

• 應(yīng)該使用HPLC級(jí)的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換。一般在水相和與其不能混溶的溶劑切換時(shí)，使用異丙醇作為過(guò)渡溶劑。

• 注意溶劑的截止波長(zhǎng)。截止波長(zhǎng)是指該溶劑可以在紫外檢測(cè)器中使用的最低波長(zhǎng),低于該波長(zhǎng)后,溶劑會(huì)有很強(qiáng)的紫外吸收，從而影響基線的穩(wěn)定性、干擾對(duì)所分析物質(zhì)的檢測(cè)。

• HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾過(guò)的(RRLC則必須使用0.2μm濾膜過(guò)濾)。建議每天更換新鮮的水。長(zhǎng)期不用時(shí)，必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換，防止長(zhǎng)霉。

• 儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

• 儀器長(zhǎng)期不用時(shí)，最好不要使用純乙腈封存。因?yàn)橐译嬗猩删酆衔锏内厔?shì)。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

2、動(dòng)力（泵）模塊

高效液相色譜儀一般是采用四元泵或者二元泵。四元泵在常壓下將兩種（或多元溶劑）輸至混合器中混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。因溶劑混合在低壓下進(jìn)行，故稱低壓混合系統(tǒng)。二元泵用兩個(gè)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入混合器，進(jìn)行混合后再進(jìn)入色譜柱。因溶劑混合在高壓下進(jìn)行，故稱高壓混合系統(tǒng)。Waters公司的Alliance系列的采用的是四元低壓混合梯度泵（帶在線真空脫氣機(jī)），作為其主流產(chǎn)品。當(dāng)然Waters公司保留了二元高壓混合梯度泵Brezee系列，作為普及型的產(chǎn)品。 島津公司推出的LC-2010系列只有四元低壓混合梯度泵一種泵型。安捷倫公司的1100系列將在線脫空氣機(jī)和四元低壓混合梯度泵結(jié)合，解決了氣泡問(wèn)題。以下是關(guān)于高效液相泵模塊的常見(jiàn)注意事項(xiàng)：

四元泵的工作示意圖

二元泵的工作示意圖

• 將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機(jī)溶劑接在上面的梯度閥口上。

• 用水定期沖洗除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。

• 操作泵之前，用至少兩個(gè)體積(標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30mL，對(duì)微脫氣機(jī)10mL)沖洗真

• 空脫氣機(jī)，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時(shí)間后(例如，過(guò)夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時(shí)。

• 當(dāng)使用低流速時(shí)（不高于0.2ml/min），檢查所有1/16英寸接頭有無(wú)滲漏（用壓力測(cè)試或漏液測(cè)試）。

• 更換活塞密封墊時(shí)檢查活塞桿上是否有劃痕，有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命，所以要盡早更換有劃痕的活塞。

• 使用緩沖溶液時(shí)，關(guān)泵前要先用水沖洗系統(tǒng)。當(dāng)需要長(zhǎng)時(shí)間使用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時(shí)，最好選用密封墊清洗附件以減少對(duì)密封墊及活塞桿的磨損。

• 如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以用熱水（50－60℃）來(lái)沖洗鹽通道來(lái)確保沒(méi)有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。

• 當(dāng)泵頭安裝有柱塞清洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力。所以開(kāi)泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調(diào)至約2－3滴/分鐘使溶液流過(guò)沖洗裝置。10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。

• 泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度。

3、自動(dòng)進(jìn)樣器模塊

不同品牌和型號(hào)的高效液相色譜的自動(dòng)進(jìn)樣器模塊有一定的差別。在這里我們介紹幾個(gè)經(jīng)典的自動(dòng)進(jìn)樣器模塊及其使用注意事項(xiàng)：

安捷倫1260 Infinity液相色譜儀的自動(dòng)進(jìn)樣器模塊如下圖所示，其注意事項(xiàng)主要是：

• 樣品在進(jìn)樣前必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)念A(yù)先處理，需要經(jīng)過(guò)亞微米濾膜的過(guò)濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路。

• 最好使用流動(dòng)相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有較好的溶解性。所分析樣品在流動(dòng)相中溶解性不太好時(shí)，使用強(qiáng)溶劑溶劑樣品容易造成峰形很差的前伸峰。

• 針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時(shí)空氣中的較大灰塵顆粒可能恰好落在針座的流路內(nèi)而引起針座的堵塞。這時(shí)候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問(wèn)題。

• ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋；使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會(huì)引起ALS故障率的增加及性能的降低。

• 如果有自動(dòng)進(jìn)樣器的保溫模塊，注意冷凝水的管線要保持通暢，并且不要處于廢液瓶液面以下。

• 自動(dòng)進(jìn)樣器與恒溫模塊后的控制線，一定要在拔掉電源線后，才可以安裝或者移除。

對(duì)于賽默飛WPS-3000 Auto sampler(SL)：

• 當(dāng)使用專用清洗液瓶時(shí)，應(yīng)在每次開(kāi)機(jī)前將瓶中的溶劑換成脫氣的溶劑，并注意檢查量是否充足。

• 使用溶劑通道液體作為清洗液時(shí)，應(yīng)在泵內(nèi)置脫氣機(jī)完成流動(dòng)相脫氣及泵排氣泡后執(zhí)行相應(yīng)的操作，以免引入氣體。

• 樣品瓶、多孔板及樣品托盤重新放置后，應(yīng)對(duì)其放置是否正確進(jìn)行確認(rèn)，以免造成進(jìn)樣針的損壞。

• 在使用非標(biāo)準(zhǔn)樣品容器或襯管時(shí)，應(yīng)注意測(cè)量瓶底的高度和寬度并對(duì)進(jìn)樣針插入高度進(jìn)行相應(yīng)的修改。

對(duì)于島津SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣針不容易扎進(jìn)去進(jìn)樣不平行，這個(gè)可以換預(yù)開(kāi)口的隔墊解決。普通的SIL-20A只能耐壓20MPa，在使用時(shí)注意不要超過(guò)壓力限。 

4、柱溫箱模塊

使用液相色譜進(jìn)行分析時(shí)，柱溫箱對(duì)實(shí)驗(yàn)分析的穩(wěn)定性高、靈敏度、重現(xiàn)性作出了重要的貢獻(xiàn)。柱溫箱主要作用在于使柱子的溫度保持一定，按照溫度調(diào)節(jié)方式大致分為：空氣循環(huán)式、水夾套式以及模塊加熱式。液相色譜法支配分離的的方式有：分配、吸附、離子交換、尺寸排除，這些平衡依賴于溫度，通過(guò)柱溫箱維持柱溫，似的在試樣的分離，選擇性以及保留時(shí)間上得到良好的重現(xiàn)性。另外由于溫度越高，目標(biāo)成分與固定相的平衡變快，柱效將增長(zhǎng)，分離也會(huì)有所改善。另外柱溫箱有助于穩(wěn)定電信號(hào)，減少信號(hào)波動(dòng)，也有利于降低液體的粘度從而降低柱壓。以下是關(guān)于高效液相柱溫箱模塊的常見(jiàn)注意事項(xiàng)：

• 連接的管路要盡量短，防止熱擴(kuò)散及峰增寬。

• 如果使用小體積分析柱以及流速小于0.2mL/min時(shí)建議使用左邊的柱溫箱(左邊體積較少,3uL；右邊為6uL)，也可使用低擴(kuò)散組件。

• 除非特殊應(yīng)用，建議將兩邊溫度設(shè)置一樣。

• 在使用冷卻功能時(shí)，要防止因冷凝水而觸發(fā)漏液傳感器。

• 一般分析柱接到左邊3μL內(nèi)體積的加熱塊上，半制備柱可以接在右邊6μL內(nèi)體積的加熱塊上。如果必要，如做GPC（Gel Permeation Chromatography，凝膠滲透色譜分析）等對(duì)穩(wěn)定要求高的分析時(shí)，可以將兩個(gè)加熱塊串接，得到更好的溫度穩(wěn)定性。

• 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要關(guān)好前蓋。

• 換柱的時(shí)候，注意螺絲一定要注意，先用手旋緊后，再用扳手旋緊。

參考文獻(xiàn)

1.YinH, Killeen K. The fundamental aspects and applications of Agilent HPLC‐Chip[J].Journal of separation science, 2007, 30(10): 1427-1434.

2. McMasterM C, HPLC A. A Practical User’s Guide [M]. VCH, New York, 1994.

3.SnyderL R, Kirkland J J, Glajch J L. Practical HPLC method development[M]. John Wiley& Sons, 2012.

4. 島津SIL-20A/AC用戶手冊(cè)

5. 安捷倫1260G1329-97015用戶手冊(cè)

6. 賽默飛WPS-3000用戶手冊(cè)

7. 日立Primaide1210自動(dòng)進(jìn)樣器說(shuō)明