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嘉峪檢測網 2020-10-26 09:37
降解試驗目的
“Stability testing of New Drug Substances and Products” ICH Q1A (R2)要求，原料藥需進行強制降解試驗以闡明其結構的穩定性，同時有助于識別其可能產生的降解產物。2015年，CFDA發布的《化學藥物(原料藥和制劑)穩定性研究技術指導原則(修訂)》中指出，原料藥的穩定性研究需進行影響因素試驗，即“通過給予原料藥較為劇烈的試驗條件，如高溫、高濕、光照、酸、堿、氧化等，考察其在相應條件下的降解情況，以了解試驗原料藥對光、濕、熱、酸、堿、氧化等的敏感性、可能的降解途徑及產生的降解產物，并為包裝材料的選擇提供參考信息。”
強制降解實際情況
然而，指南中僅建議了溫度(如50度、60度)、濕度(如75%RH或更高)、光(參見ICH Q1B)的降解試驗條件，對于酸、堿、氧化試驗沒有做過多的描述。因此，在具體試驗過程中，我們常常會有這樣的困惑：
1)什么樣的反應物能有助于降解試驗？
2)在進行氧化降解時，什么樣的氧化劑最佳？
3)進行酸降解時，能否使用硫酸代替鹽酸？
4)如果*前一次的降解試驗沒有得到足夠的降解產物，那么，我們該采用什么極端的條件以獲得足夠用于分離鑒別的降解產物？
5)是否有這樣或那樣的條件，我們滿足后就可停止或不需再進一步的試驗？
酸降解
在進行酸降解時常用0.1N ~ 1.0N HCl，也有使用更濃的HCl；而除了使用鹽酸外，也有使用不同濃度硫酸作為酸降解試劑。同時，不同酸降解的反應條件也是多種多樣，反應溫度從40度到110度，甚者采用回流或沸騰條件，反應時間也從1小時到2個月不等。有的藥物，如奧美拉唑，選用0.5N的硫酸回流5min即完全降解，而頭孢氨芐在同樣條件下一點沒有發生降解；有的藥物在0.1N鹽酸條件下回流1周也未發生降解。
堿降解
NaOH是常用的堿降解試劑，濃度從0.1N到1.0N不等，有時也使用KOH，但使用得比較少。與酸降解一樣，對于堿降解的反應溫度變化也很大，從30度到100度甚至沸騰或回流。由于不同分子內部結構的差異，有些分子在0.1N氫氧化鈉條件下沸騰一周未發生降解，而有些分子如三氟拉嗪在0.1N氫氧化鈉、30度溫度下放置24小時即可發生完全降解。同理，當使用1N的NaOH時，有些分子如雷尼替丁，沸騰20min即可降解至84.4%，而諾氟沙星在100度下進行15小時也未發生降解。
氧破壞
在進行氧破壞的氧化劑中，常用的氧化劑為雙氧水，濃度為1%到30%。有些藥物比較容易發生氧降解，如鹽酸雷尼替丁和鹽酸西咪替丁，使用3%的濃度在室溫下即可較快完成降解試驗；而有的藥物如鹽酸舍曲林，在濃度為10%條件下回流6個小時也未發生一點的降解。這表明，有些藥物是易被氧化的，而有的藥物則不易被氧化，甚至使用更高濃度的氧化劑也不會氧化降解。
光降解
很多光降解試驗表明，在進行光降解時，光降解條件也非一成不變的。根據藥物特點，藥物可暴露于長波長或短波長的紫外燈下，也可暴露于400-1580fc的日光燈下，試驗溫度一般為室溫或接近室溫，試驗周期為幾個小時到幾個月不等，依賴于光源強度。鹽酸西咪替丁在UV下進行幾個月也未發生降解；維生素A酸在UV下2h即降解了一半。
決策樹
藥物分類
根據藥物的穩定性情況，我們可以將它們分為六類：極不穩定、很不穩定、不穩定、穩定、非常穩定、極度穩定。
光降解中，根據ICH光降解條件將藥物分為兩類：對光敏感和對光不敏感，即如果藥物在ICH推薦的光條件下(1.2*106 lux h)能充分分解或完全降解，那么該藥物為對光敏感類藥物；否則，將總照度改為6.0*106 lux h。
當我們拿到一個新藥物時，我們一般首先將它默認為是第三類“不穩定”藥物，然后根據反應結果來判斷是否需要加大或弱化降解反應條件。
酸/堿降解
為了研究藥物在酸/堿條件下的水解過程，我們可以先從0.1N HCl/NaOH回流8小時開始，認為藥物是不穩定的，見下圖決策樹：
如果能夠獲得足夠降解產物或者說能達到試驗目的，那么就可不必再進行深究試驗；如果藥物沒有發生降解，則可以增加酸/堿的濃度，同時增加反應時間；依次類推。如果藥物在5N濃度下回流24小時(苛刻條件)還未發生降解，則該藥物為“極度穩定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應降低酸/堿濃度，同時降低反應溫度；若濃度降低至0.01N、反應時間降低至2h、反應溫度降低至25度(接近室溫)，藥物仍能充分降解，則該藥物為“極不穩定”一類，需探索更溫和的反應溫度和反應pH值。
從上圖的酸/堿降解決策樹中可發現，推薦的起始降解條件為0.1N酸/堿，回流8小時；假如起始降解條件不滿足降解要求，則惡化降解條件。不推薦直接采用惡化條件進行降解試驗：1)直接采用更惡劣的降解條件，可能會改變藥物降解的路徑或反應機制；2)濃度過高的酸或堿對HPLC柱子有損傷。
在進行降解試驗前了解一下藥物分子的結構信息有時也是有幫助的，如，藥物小分子上有一個酯基，酯基易于水解，那么我們可能使用低濃度的堿即可完成試驗。
氧破壞
為了研究藥物氧破壞的難易程度，我們可以先將藥物放置于3% H2O2在室溫下反應6小時作為起始條件，見下圖決策樹：
如果能夠獲得足夠降解產物或者說能達到試驗目的，那么就可不必再進行深究試驗；如果藥物沒有發生降解，則可以先增加反應時間，由原來的6小時提高至24小時；如果藥物仍未發生降解，則可以增加氧化劑濃度，由3%提高到10%；若還未降解，則氧化劑濃度可提高至30%；若藥物在30%H2O2濃度下反應24小時仍不能發生降解，則該藥物為“極度穩定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應降低H2O2的濃度，從3%降低至1%，同時縮短反應時間；若氧化劑濃度降低至1%、反應時間降低至30min，藥物仍能完全降解，則需探索更低氧化劑濃度和更短的反應時間。
金屬離子有助于氧化反應的進行，是氧化反應的催化劑，因此，有時額外補加一點金屬離子，氧降解反應會增加幾千倍，如銅有助于將維生素C的氧降解提高1萬倍。但并非所有的氧降解加金屬離子均可以，有時加入金屬離子會使原有的降解路線發生改變。
光降解
光降解與其它條件有所不同，藥物的起始反應條件與ICH推薦的一致，即1.2*106 lux h，若在此條件下未發生降解，則可將總照度提高至5倍，即6.0*106 lux h；若此條件下藥物仍未發生降解，則該藥物為“對光不敏感”一類。
對于光降解試驗，建議主要還是遵從ICH Q1B指南，可采用任何輸出相似于D65/ID65發射標準的光源，如具有可見-紫外輸出的人造日光熒光燈、氙燈或金屬鹵化物燈，因此，可嘗試符合ICH要求的不同燈源。若采用氙燈，達到目標總照度(1.2*106Lux hr)一般需要4小時左右，如果采用熒光燈或近UV燈，按輸出5000-10000lux算需要5-10天才能達到目標總照度。有時，我們可以直接將樣品置于太陽光照下進行降解試驗。在炎熱的夏天，樣品置于太陽下光照4小時產生的降解程度與樣品置于氙燈或金屬鹵化物燈下光照8天降解程度差不多。但需要注意的是，一年中太陽光的照度隨季節在變。
需要注意的是，不管光降解反應的現象如何，仿制藥的說明書均應與RLD的一致。
降解試驗注意事項
樣品濃度與降解程度
根據不同文獻報道，加上實際經驗，進行強制降解時推薦的起始樣品研究濃度為1 mg/ml(后期可根據實際情況而決定是否需要調整)，如果樣品溶解性差而達不到這個濃度的，可在樣品中加入甲醇。樣品濃度若太小，則有可能部分降解產物因濃度太低而不能被檢測到。而對于溶液劑，推薦采用最終的處方濃度同時進行試驗，因為有些藥物如氨基青霉素，在一定濃度下會發生聚集現象，低濃度下藥物很少發生聚集。
對于小分子藥物而言，強制降解一般以主成分降解5% - 20%為宜；而對于要求含量為標示量的90% - 110%的小分子而言，建議最大主成分降解為10%。過度的降解容易造成二次降解產物，而這些二級產物又可能不會出現在藥物貨架期穩定性研究期間內產生，即不符合降解試驗的最終目的。
樣品處理方式
樣品經過酸、堿、氧化劑降解后，一般含有較高濃度的殘留反應劑，直接進樣會有損液相及色譜柱。對于樣品的處理，可采用稀釋法或中和法，其中稀釋法更為推薦。對于稀釋法，即將樣品中殘留的反應劑通過稀釋至能夠耐受的范圍內：如果采用HPLC法，稀釋劑可使用流動相；如果采用TLC法，稀釋劑可采用甲醇、乙醇等。對于酸堿中和法，即在樣品中加入酸或堿，使樣品溶液的pH將至耐受范圍內。稀釋法操作更簡單，而中合法難以把控終點。
實驗設計建議
對于強制降解試驗，我們最好是能準備四種樣品進行對比試驗：1)放置于常規條件下的空白溶液；2)放置于降解條件下的空白溶液；3)放置于常規條件下的樣品溶液；4)放置于降解條件下的樣品溶液。最終通過對這四種溶液的綜合判斷評估真實的降解產物。
在進行降解試驗過程中，間隔取樣有時是有必要的，有利于闡明降解過程、從而識別降解產物到底是一級降解產物還是二級降解產物。
在使用藥典和USP <621>中概述的限制使用的方法，降解試驗是沒有必要研究的。同一個藥物的不同晶型可能具有不同的穩定性特征，當一個仿制藥產品晶型不同于RLD產品晶型時，原料藥應進行降解試驗來評價多晶型藥物的理化變化。
參考資料：
1. Guidance on Conduct of Stress Tests to Determine Inherent Stability of Drugs
2. FDA Perspectives: Scientific Considerations of Forced Degradation Studies in ANDA Submissions
3. ICH Q1A (R2)、Q1B
4. 化學藥物(原料藥和制劑)穩定性研究技術指導原則(修訂)
來源：藥渡
