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嘉峪檢測網 2020-12-10 17:24
1.前言
病毒,一類嚴格的細胞內寄生物。在宿主細胞外環境，病毒既不能獨立進行代謝活動，也不能進行繁殖，只能以顆粒形態存在，即病毒體(virion)的形態存在。病毒死亡，由蛋白質外殼的分裂和核酸退化導致的病毒濃度隨時間的降低。死亡的病毒不會感染宿主細胞, 因而喪失對人畜健康危害（沒有生物活性，不能主動進入細胞，也不能在細胞內進行復制）[1]。清除病毒的方法有很多，按病毒去除/滅活方式的不同，可分為有機溶劑/去污劑（S/D)法、低pH值孵放法、膜過濾法、紫外法、超短時微波加熱法、巴氏消毒法和干熱法等[24]。下面將介紹一些常見病毒去除/滅活方法。
圖為病毒結構
（出自胡志紅、陳新文主編的《普通病毒學》）
2.病毒去除/滅活技術介紹
2.1有機溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法
過去，人們發現甲肝病毒能通過消化道傳播，乙肝病毒通常不能通過消化道傳播，但是在膽汁分泌障礙人群體內，乙肝病毒能通過消化道傳播的概率較高。后來，科學研究發現，這與膽汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有關。根據以上原理，通過研究和臨床觀察發現，使用Triton-X 45這類的非離子型表面活性劑（去污劑）和磷酸三丁酯（有機溶劑）能夠有效破壞類似乙肝病毒的類脂膜：類脂從病毒表面脫落，使病毒失去黏附和感染細胞的能力，從而達到滅活病毒的效果，且對蛋白質分子的結構的影響也非常小[4]。這種方法就是有機溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法。
因S/D法具有較高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到現有或新開發的純化工藝中等優點[16]，人們便將這種滅毒方法用于血漿、血液制品和生物制品[8,17,18,19]。S/D法作為血漿病原體滅活技術，是最早得到醫療界的認可，并投入臨床中的。因為S/D法滿足了以下三點：①能完全有效滅活胞內、胞外病原體及附著在細胞上的病原體；②所選試劑能選擇性地進入細胞且不損傷細胞；③經處理后的紅細胞不產生新抗原或者抗體，對人體無害。因為S/D病毒滅活處理對多種不同的包膜病毒都能發揮有效的病毒滅活作用,且有良好的臨床安全性，因此其通過美國FDA許可,以用于濃縮的人血液Ⅷ因子的病毒滅活,并已廣泛用于生物制品的生產[9,10,11,12]。
在使用S/D法時需要注意：①待滅活的制品中，可能存在顆粒性物質會將病毒包裹其中，這會使S/D試劑無法接觸到病毒。因此，需要對制品事先進行1μm或更高的精度的過濾以避免這種風險。②加入S/D后制品應充分混勻，如果加入S/D后再進行過濾，應確保過濾后S/D濃度仍在有效范圍內。③S/D試劑要能夠與混合容器內每一滴制品接觸（特別是罐壁、灌頂上附著的制品可能在滅活工藝結束后又滴入罐內），因此通常是將加入S/D后的制品混合均勻后，泵入另外的容器內恒溫，執行滅活程序。④病毒滅活間與后面的生產工序間需要分開，以免造成交叉污染。
S/D法缺點也比較明顯：這種滅活方法僅對脂包膜病毒有效，對于非脂包膜病毒無任何效果。而且，雖然S/D法現在被廣泛應用于臨床，但也存在基因毒性、處理物及其衍生物殘留﹑滅活后部分凝血因子減低等問題。
2.2低pH孵放技術
低pH孵放法，是一種化學病毒去除/滅活技術，常用于單克隆抗體的病毒滅活工藝。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的條件下，電荷會發生改變，蛋白質的空間結構也會發生不可逆的改變，從而使病毒喪失侵染細胞的能力。簡單來說，低pH孵放法是破壞病毒包膜的完整性、阻斷病毒與宿主受體結合的途徑，使病毒無法感染宿主細胞，起到滅活病毒的作用[20,21,22,23]。
低pH孵放法雖然因其操作過程簡單、病毒滅活效果好，成為重組蛋白藥物純化工藝中常用的關鍵步驟，但低pH環境容易使重組蛋白不穩定，產生聚體、降解等質量問題。相比較而言，由于抗體類免疫球蛋白在低pH環境普遍表現更加穩定，因此低pH孵放法主要應用在IgG類產品。另外，低pH孵放法具有方法簡單、經濟實惠、容易操作等特點，已被用于偽狂犬病毒、豬細小病毒、流感病毒等病毒的滅活[5,6]。
在工藝操作過程中需要注意：本方法對于無脂包膜類病毒作用微弱（僅部分非脂包膜病毒有效），但在工藝中的低pH（如pH 4）處理（有時加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果可能受pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質濃度、溶質含量等因素影響。隨著pH升高，滅活效果降低，隨著溫度升高，滅活效果升高，通常可以達到5~6LRV滅活效果。在pH 3.7、pH 3.8時，其滅活效果會受多因素干擾。而樣品中含有一定量的精氨酸時可以改善病毒滅活效果，即使在pH 4.0的條件下也有顯著的滅活效果。低pH孵放不僅可以滅活有脂包膜類病毒，還可以沉淀HCP、DNA等雜質，對純化工藝中的雜質去除也起到重要作用[5,6]。
2.3納米膜過濾技術
納米膜過濾技術是一種通過孔徑大小過濾來濾除病毒的技術，多用于血液制品和生物制品中的病毒去除，其可以有效去除非脂包膜病毒。作為生物制品凈化過程中最常用的技術之一，其目的是達到有效的凈化效果，保證生物制品的安全[25]。得益于生物治療產品如單克隆抗體、干細胞產品、血液成分、生物制劑和疫苗不斷增長的需求，未來幾年全球病毒過濾市場預計呈現增長的趨勢。
納米膜過濾是利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內，從而達到去除病毒的效果[7]。納米膜過濾可以同時滿足病毒去除效果好、目的蛋白質通過性高（回收量、過濾時間）、目的蛋白質不變性的特點，另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒，無論病毒基因組是RNA還是DNA，基本靠孔徑大小來去除病毒，所以是當前最可靠的病毒去除、滅活技術。根據目的蛋白的大小，可以選擇平均孔徑不同的濾膜。在濾過產品中，平均孔徑為20 nm左右的產品被稱為細小病毒濾膜。近年來，由于去除小病毒的需求的提高，這種產品得到了廣泛的應用。其中平均孔徑35~50 nm的濾膜被稱為逆轉錄酶病毒濾膜[2,3]。
在實際的生產過程中，為了提高蛋白回收率，需要暫停壓力，然后將流路切換到清洗緩沖槽進行后沖洗。病毒過濾的最劣條件之一是高TMP（跨膜壓差）。近年來的報告表明，過濾過程中壓力的釋放及之后的再加壓都會影響病毒去除效果。特別是在添加細小病毒和噬菌體進行的實驗中，在壓力暫停后再次加壓，會從濾液中檢測出病毒粒子。這種現象不是某種病毒濾膜所特有的，而是所有病毒濾膜產品的普遍現象。發生這種現象的原因在于，暫停壓力后，被截留在膜內的病毒粒子會再進行布朗運動，離開膜壁，再次加壓后，附近若有粒徑較大的濾孔，病毒粒子又會通過而漏出膜外。當然，這不意味著病毒粒子一定會漏出。病毒漏出與否、漏出量取決于過濾對象溶液的性質、過濾壓力、壓力暫停時間、病毒種類、病毒滴度/量和病毒濾膜的種類[2][3]。
為了判斷生產工藝的影響，需要使用模擬實際工藝的縮小模型進行病毒去除試驗。如果生產工藝中有壓力釋放過程的話，做病毒驗證實驗方案時要考慮這一因素。實際生產過程中的流路一般會有閥門，在模擬時可以使用旋塞來代替閥門，盡可能使用試驗流路接近實際的生產環境。如果觀察到病毒漏出，可以通過改變過濾條件來降低或消除風險。壓力釋放的影響取決于具體情況，應設想在預想不到的壓力釋放的情況下，是繼續過濾，還是更換濾膜，針對不同的蛋白提前采取對應措施是有意義的。
2.4紫外燈照射法
紫外燈殺毒法的主要儀器是紫外線殺菌燈。紫外線殺菌燈通常也被稱為紫外線消毒燈或紫外線熒光燈，是一種利用紫外線的殺菌作用進行滅菌消毒的燈具。紫外線殺菌燈消毒原理主要是在特定的波長范圍（燈波長為200~275nm,殺菌作用最強的波段是250~270nm）以及足夠高的劑量下，通過輻射損傷和破壞微生物的核酸功能來殺滅微生物等病原體[26]。具體來說，是紫外線對核酸的作用引起細菌和病毒等微生物細胞中DNA或RNA相鄰嘧啶分子間形成異常的化學鍵，從而阻礙DNA或RNA的復制，而且在紫外線燈殺菌的過程中還會產生臭氧，臭氧本身就能從外而內的逐步破壞病毒結構，從而造成微生物細胞死亡，以達到消毒的目的[13,14,15]。
常見的紫外線殺菌消毒屬于照射消毒，只需將紫外線殺菌燈照射需要消毒的物品，或在需要殺菌消毒的環境放置紫外線殺菌燈（使用時可將紫外線消毒燈懸吊于處方上方1m或將處方置于紫外線消毒箱內）即可。紫外線可集中很高的強度在短時間內殺滅細菌和病毒，屬于純物理消毒方法[13]。
紫外線消毒具有性能穩定、使用維護便捷、運行成本低、對環境友好等優點,但是紫外線穿透能力弱，僅對直接照射的物體表面有消毒作用,所以消毒處方時應保證每張處方的正反兩面均受到照射。另外，紫外線可對皮膚黏膜造成損害,因 此使用時應避免直接照射到人[14,15]。
紫外線燈在使用過程中會產生臭氧。臭氧的濃度過高會使人產生頭暈、惡心等癥狀，甚至會引發呼吸道的病變。而長期錯誤使用紫外線燈會對人眼睛產生危害：誘發結膜、角膜等疾病，嚴重的甚至會影響視力。不僅如此，如果長期照射到皮膚上，輕者會出現紅腫、瘙癢等癥，重者甚至會引發皮膚癌[14,15]。
圖為一種正在運行的迷你紫外燈消毒箱
3.小結
當前廣泛使用的病毒滅活方法有S/D法、低pH孵放法、膜過濾法、紫外法等，本文也對這些方法進行了一些介紹。雖然每種病毒滅活方法都可以滅活常見的病毒，但每種方法都有其局限性。國內IND申報時，一般選擇低pH和膜過濾這兩個工藝。國外進行申報時，除了選擇低pH和膜過濾這兩個工藝，還需進行層析工藝（層析法最常用的是親和層析和離子交換層析。層析法是目前常用的樣品不同組分分離技術，利用各組分與固定相親和力的差異或相互作用不同的原理，實現病毒與樣品分離的目的）。
去除/滅活病毒的理想方法有2個特性：①可以部分去除病毒或者破壞病毒的活性和結構。②維持生物制品的生物活性、理化性質。
當掌握對某種病毒的精準去除/滅活或能夠對產品中所有的病毒進行去除/滅活，并保證產品功能性質完整時，消毒后的產品才能具有效益和繼續增加效益。
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來源：無菌動物
