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摘要

基因毒性雜質的限度確定是藥物安全研究的重要內容。有潛在基因毒性的雜質根據其結構特征和毒理學數據可分為5 類: 已知有致突變性及致癌性的雜質、有致突變性但致癌性未知的雜質、含有與藥物活性成分結構無關的警示結構但無致突變性數據的雜質、含與藥物活性成分相關警示結構的雜質以及致癌風險高的特殊雜質。本文以毒理學評價的方法，分類對基因毒性雜質的評估策略進行綜述，并示例雜質限度確定的方法。

關鍵詞

基因毒性雜質; 安全性評價; 毒理學

基因毒性雜質是藥物在合成、儲存或者制劑過程中形成的能與細胞或生物體的DNA 反應，對DNA 有潛在破壞性的雜質，也包括一些結構上類似基因毒性物質但未經實驗證明具有基因毒性的雜質。

基因毒性物質的特點是在任何暴露量下都有可能對DNA 產生損傷，進而可能誘發腫瘤。因其毒性較強、潛在風險大，對用藥的安全性有強烈的威脅。近年來在已上市藥品中因為痕量的基因毒性雜質殘留而引發的醫療事故和禁售事件也陸續被發現，如最早引發關注的甲磺酸奈非那韋事件和近兩年出現的N-亞硝基二甲胺事件，因此人用藥品注冊技術要求國際協調會議( ICH) 、歐洲EMEA 及美國FDA 等機構都陸續提出了基因毒性雜質研究策略和限度要求［1］，我國國家藥品監督管理局藥品審評中心( CDE)也于2020 年5 月8 日發布了《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則( 試行) 》［2］，為“關注雜質”的研究和控制提供指導，國內外醫藥機構在新藥研發過程中也越來越關注基因毒性雜質的控制和檢測。

雜質在化合物合成過程中是難以避免的，且種類多、分類困難，為了區分普通雜質和基因毒性雜質，各法規和指導原則普遍采用了“警示結構”的方法，將可能引起基因毒性的結構列入關注隊列，含有這些基團的雜質通常被認為具有潛在基因毒性。化合物是否含基因毒性雜質可以通過化學反應機制來分析確認，實際產生的有明確遺傳毒性閾值的雜質，可以通過制定限度標準將暴露水平限定在安全范圍內; 對于有潛在基因毒性的雜質，可通過查詢“警示結構”數據庫來確認，這類雜質由于沒有充分的證據或實驗來支持其閾值相關機制，所以無法確定安全劑量，需要進行藥學和毒理學評估。

藥學評估主要是選擇適當的配方和生產策略，以避免或減少基因毒性雜質的產生，在遵循“合理可行的最低限量”( as low as reasonably practicable，ALAＲP) 原則的基礎上，再經過毒理學評估以驗證其合理性。

基因毒性雜質的毒理學評估遵循“具體問題具體分析”原則［3］，本文根據雜質的結構特征和毒理學數據，將雜質分為5 類分別對毒理學評估策略進行綜述，并示例雜質限度確定的方法。

1、基因毒性雜質的毒理學評估策略

1、1已知有致突變致癌性的雜質，包括具有足夠遺傳毒性作用機制數據的動物致癌物和人類致癌物這類物質可基于文獻報道和數據庫來確認，其致突變和致癌性實驗結果為陽性，但是只有在超過一定限度才產生毒性效應。對于有足夠致癌性數據的物質，可以直接采用已公布的測定數據制定限度標準，或根據動物致癌性強度數據，采用線性外推法計算人體可接受攝入量; 對于有明確遺傳毒性閾值的物質，可以參照ICH Q3C 的方法，根據相關動物實驗的“未觀察到效應水平”( no-observed effect level，NOEL) 或“觀察到有害效應的最低水平”( lowest-observedadverse effect level，LOAEL) ，計算“每日允許暴露量”( permissible daily exposure，PDE) 。致突變致癌物數據主要來源于毒理學研究結果，因此對于權威數據庫中已列出的基因毒性雜質，可根據已知數據將雜質限定在安全限度之下，無需再進行毒理學實驗。此類雜質在藥物研發和生產過程中應盡量避免產生，如果無法避免，應該優化相關工藝以減少其含量，并制定合理的分析檢測方法進行限度控制。

1、2 已知具有致突變性但致癌性未知的雜質這類物質通常在體外遺傳毒性實驗中為陽性結果，如細菌回復突變實驗、染色體畸變實驗，但是嚙齒類動物的致癌性數據未見報告。在缺乏體內關聯信息時，通常體外基因毒性物質也被假定為體內誘變劑和致癌劑，但由于缺乏產生生物學意義的閾值數據，安全暴露水平無法確定，因此在歐洲EMA 發布的《基因毒性雜質限度指導原則》中引入了“毒理學關注閾值”( threshold of toxicological concern，TTC) 的概念，為無法確定暴露水平的基因毒性雜質提供一個可接受的攝入水平，通常認為攝入量在低于此水平時患癌的風險將遠低于正常風險水平，經過對多個致癌性物質的致癌能力概率分布進行分析驗證，得到適用于大多數致癌物質的TTC 估值為每人1． 5μg·d －1。因此對于無法確定閾值的基因毒性雜質，通常認為人每日攝入量低于1． 5 μg 時，誘發癌變的風險是可以接受的。一些特殊的不宜采用TTC 評估的雜質，如果在體外遺傳毒性實驗中呈陽性結果，也可以采用一些反應機制相似或具有預期靶組織暴露的體內試驗( 如微核試驗、體內基因突變試驗、彗星試驗等［3］) 進行關聯性研究，為設定限度指標提供數據支持。

對于一些例外情況，如短期用藥，用來治療威脅生命疾病的藥物，用藥者的存活期預期較短，或該雜質由其他途徑獲得的暴露量遠高于藥物時，需要進行風險效益評估，必要時TTC 值可以高于1． 5 μg·d－1。

1、3含有與藥物活性成分結構無關的警示結構但無致突變性數據的雜質警示結構的重要性在于提示可能存在的基因毒性和致癌性，為進一步安全性評價和制定控制策略指明方向，但具有警示結構并不一定具有基因毒性，因此對這一類雜質，需要通過毒理學方法來評價，通常采用細菌回復突變實驗檢測分離的雜質或雜質與藥物活性成分的混合物，如果實驗結果為陰性，可按照一般雜質控制，如果細菌回復突變實驗顯示警示結構具有基因毒性，可采用TTC 來確定限度，必要時根據體外實驗的陽性結果追加合適的體內試驗進一步驗證。例如，對于細菌回復突變實驗在非S9 代謝活化條件下出現的陽性結果，可采用Pig-a 基因突變實驗來檢測直接作用的致突變物，或采用微核試驗檢測直接誘變劑和染色體斷裂劑; 如果細菌回復突變實驗的陽性結果僅出現在S9 代謝活化條件下，且推測該雜質可在肝臟誘導大的加合物，可采用大鼠肝臟程序外DNA 合成實驗; 如果已有信息表明雜質具有導致DNA 前期損傷的化學結構特異性作用，如形成堿基不穩定位點或單鏈斷裂，可選擇彗星試驗。

1、4警示結構與藥物活性成分相關的雜質所含警示結構與藥物活性成分的結構相同，或與藥物中結構相關化合物的警示結構相同，此類雜質如果已有數據或實驗證明該警示結構無致突變性，則按一般雜質控制，不需要對雜質進行毒理學實驗。

1、5 致癌風險高的特殊雜質另外有一些特殊物質，在長期毒性研究中有確切致癌性證據，或在國際認可的數據庫中被列為高風險致癌物，如黃曲霉素類、N-亞硝基物和偶氮類化合物，它們的攝入量在低于1． 5 μg·d －1 時仍有非常高的致癌風險［4］，因此使用通常的TTC 值來評估并不合適，需要建立特定的風險評估方法，具體問題具體分析。CDE 發布的《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則( 試行) 》正是基于這類雜質的特殊性提出的，對于此類雜質，應采取“避免為主，控制為輔”的策略，在毒理學評估中，可以參考以下思路［2］。

對于在權威機構數據庫中有足夠致癌數據的雜質，可以根據其50%腫瘤發生率( TD50) 的劑量外推計算十萬分之一腫瘤發生率的劑量，以此作為該雜質的可接受攝入量，再結合藥品的每日最大用藥量，可以得到雜質的控制限度。在選擇TD50時，應選擇已有數據中最保守的值，即“來自研究設計完善的致癌性試驗中的最低TD50值，或與人類風險評估最相關的種屬、性別和腫瘤發生器官部位的最低TD50值”。如果數據庫中沒有該致癌性雜質的TD50值，可通過構-效關系分析來選擇效應相似且有TD50的同類雜質，導用其TD50值來計算雜質限度。

2、根據毒理學數據確定雜質限度的示例 

2、1根據TD50線性外推法計算N-亞硝基二甲胺( nitrosodimethylaniline，NDMA) 的可接受攝入量NDMA 被世界衛生組織國際癌癥研究機構( InternationalAgency for Ｒesearch on Cancer， IAＲC) 列為2A類致癌物，在遺傳毒性與致癌性實驗中均為陽性結果，對動物致癌證據充分，對人的致癌風險較高，因此不適合按每人1． 5 μg·d－1的TTC 值來制定限度，需要根據NDMA 的致癌性數據進行特定風險評估。致癌性數據庫( Carcinogenicity Potency Database，CPDB) ［5］提供的數據顯示，在研究完善的致癌性實驗中，NDMA 在大鼠與小鼠的TD50值分別為0． 095 9和0． 189 mg·kg－1d －1，其中大鼠的TD50值更保守。人體重以50 kg 計算，腫瘤發生風險設為0. 1，則按大鼠TD50線性推導出人對NDMA 的可接受攝入量為: 0． 095 9 mg·kg －1·d －1 × 50 kg ÷ 50% × 10 － 5 =0． 000 095 9 mg·d－1。

以2018 年7 月檢出含NDMA 雜質的纈沙坦原料藥為例，纈沙坦每日最大用藥以320 mg 計算，則其中NDMA 雜質的限度設定為: 0． 000 095 9 mg·d －1÷320mg·d －1 = 0． 000 03%。

2、2 根據“未觀察到效應水平”計算苯胺的“每日允許暴露量” 苯胺為一種已知的動物致癌物，可誘導大鼠脾臟腫瘤生成，且研究顯示其致癌性存在閾值，因此不適用TD50線性推導的方法，可采用相關動物實驗的未觀察到效應水平來計算每日允許暴露量。根據來自化學工業毒理學研究所( ChemicalIndustry Institute of Toxicology，CIIT) 一項2 年的大鼠致癌性研究數據，喂飼相當于7． 2， 22 和72 mg·kg－1·d －1苯胺劑量水平的鹽酸苯胺，在72 mg·kg－1·d－1 劑量雄性中觀察到腫瘤，并在22 mg·kg－1·d －1 劑量組發現一個脾臟間質肉瘤，基于以上數據，7． 2 mg·kg －1·d －1的劑量被用來作為腫瘤的NOEL，按ICHQ3C 中的方法使用不確定因子來計算苯胺的每日允許暴露量，PDE = ( NOEL × 體重校準) ÷ ( F1 × F2 ×F3 × F4 × F5) ，其中: 體重校準= 50 kg; F1 = 5( 從大鼠到人) 種屬間差異系數; F2 = 10 ( 個體間差異系數) ; F3 = 1 ( 研究持續時間至少為動物壽命的一半) ; F4 =10( 嚴重毒性－ 非遺傳毒性致癌性) ; F5 = 1( 使用NOEL) ，由此可計算苯胺在人體的終生PDE =7． 2 mg·kg －1·d－1×50 kg ÷ ( 5 ×10 ×1 × 10 × 1) = 0． 72mg·d －1。

3、小 結 

對于基因毒性雜質或潛在基因毒性雜質，無論其是否有閾值相關機制的證據，研究和控制的依據都是毒理學數據，尤其是遺傳毒性和致癌性實驗結果，其中最基礎的是細菌致突變實驗，通常用來評估雜質致突變的可能性及控制的必要性。但是常規遺傳毒性實驗方法存在局限性，如無法檢出非遺傳毒性致癌劑，體外實驗與體內的相關性需要驗證，且不適用于確定“可接受的攝入水平”。因此在開展毒理學評估前，首先應該查詢“警示結構”數據庫和已知致癌物數據庫，并根據文獻或計算機毒理學分析雜質的化學結構，判斷開展毒理學實驗的必要性，并預測其可能的遺傳損傷終點或作用機制，選擇檢測終點一致或能提供機制信息的實驗方法。另外由于檢測靈敏度限制，使用含雜質的原料藥進行研究，可能會由于雜質含量太低而出現陰性結果，這時使用分離出的雜質進行研究更合理。在根據毒理學數據確定雜質限度時，可參考的文獻和數據較多，使用不同的數據得出的限度會有差異［6］，只要有充分合理的依據，通常都是可以接受的。基因毒性雜質的來源和構成復雜，其安全性評價需要綜合運用多種手段，毒理學評估作為其中一個環節，也要結合化學及藥學相關知識、相關工藝和檢測技術，充分利用新方法和毒理學數據，制定合理的評估策略，同時在必要時開展機制研究，或采用體內相關性研究來幫助確定雜質的限度，將基因毒性雜質對人體的潛在威脅控制在安全范圍內。