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嘉峪檢測網 2021-05-11 12:03
1. 色譜柱使用壽命
問：我的色譜柱僅進樣了100針，就出現色譜峰變形、柱效下降，這是為什么？
答：僅進樣100針確實是很短的柱壽命。正常情況下，一根色譜柱是可以使用更長時間的。為了確定是哪里出了問題，我們首先需要確定是否只要你采用該分析方法，柱壽命就是很短。
有兩種基本情況：
1. 以前有用于該分析方法的色譜柱，其使用壽命都要長的多；
2. 所用用于該分析方法的色譜柱，在使用大致相同的進樣針數后就報廢了。
在第一種情況下，我們需考慮所用分析方法是否真的保持一致。樣品的組成有沒有改變？樣品中的強保留雜質會使柱效降低。所用儀器通路中的密封件狀態是否完好？脫落的密封件碎屑可能堵塞柱篩板和柱頭處的填料，從而影響樣品的分配。
如果能合理的確定色譜條件沒有變化，那么你可以認為問題的原因是填料床的機械性缺陷。這可能是由于實驗室使用中或運輸過程中對色譜柱的粗暴處理引起的（您將其掉落了嗎？），或者是由于制造缺陷引起。此類缺陷無法通過標準色譜柱質量控制檢測出來，只有在使用一段時間后才能顯示出來。針對后一種情況，色譜柱生產廠家將會為您免費更換色譜柱。
問: 這些色譜柱生產廠家很好，但這不是我的問題。我的色譜柱使用壽命總是很短，有時是進樣100針，有時是200針。我可以忍受200次針的使用壽命，但100針的使用壽命是不夠的。而且色譜柱價格越來越昂貴。我應該怎么辦？
答：我100％同意你的看法。我們需要做的就是一起找到導致問題的原因，然后看看可以采取什么措施來解決它。
造成上述問題最可能的原因是樣品組分被吸附在了色譜柱柱頭部分。它們可能是由于在流動相中的低溶解性而析出沉淀，或是被主動強吸附。隨著您進樣次數增多，這些污染物會堆積在色譜柱的頂部，阻礙樣品的正常吸附和分布，從而導致峰形變差。通常，這個問題通常還伴隨著系統壓力的增高。
問：好的，可能就是如此。那我應該如何解決呢？
答：有幾種方法可以防止這種情況的發生。一種是使用合適的樣品制備技術來凈化樣品。使用與分離柱化學性質相似的SPE柱進行固相萃取可很好地解決此問題。
另一種也是更有力的方法是使用保護柱。當發生上述問題時，預柱就代替了被犧牲的柱頭。為了獲得最佳性能，您應使用與分析柱有完全相同填料、并采用了相同高性能填料技術的保護柱。如果使用其他品牌填料的預柱，則在分離效能和保護分析柱方面都無法達到最佳。另外，請勿使用更大粒徑的預柱，大粒徑或填充不好的預柱可能由于預柱中譜帶變寬導致分離效能下降。
問：使用預柱聽起來不錯。你還有其他解決辦法嗎？
答：嗯..也不是能說沒有，還有其他幾種，但他們各有各的缺點。
我不主張使用理論上能溶解色譜柱頂部污染物的溶劑進行色譜柱“洗滌”。在許多情況下，這根本行不通。例如，如果污染物是沉淀在色譜柱頭部的蛋白質，那么當您嘗試將其洗掉時，它們已經因變性而大量老化，甚至發生交聯以致無法再次溶解。此外，每次沖洗還會帶走水解的鍵合相，如果不沖洗該鍵合相應該是在發生水解的位置處保持局部平衡的。因此，重復清洗實際上可能導致色譜柱的加速老化。還有，每次沖洗后你還需要用流動相對色譜柱進行再平衡，再平衡過程在部分情況下將會非常耗時，如使用離子對色譜法。
經常嘗試的另一種方法是反沖色譜柱。如果使用與流動相不同的溶劑進行沖洗，那么我們反對的理由就與色譜柱沖洗一樣。如果使用流動相沖洗，那么就會花大量時間直到污染物被沖洗出來，也可能甚至根本就沖洗不出來。同樣，任何的反沖都會傷害色譜柱。即使今天的色譜柱被填充的足夠好，可以承受反沖，我仍不建議將其作為標準操作。
問：所以你給出的最好建議就是使用預柱？
答：完全正確。使用預柱花費不大——根據品牌和類型不同，價格在$10~$50之間——而他們保護的色譜柱價格通常是其價格的10倍。此外，它們還可以保護您的色譜柱免受其他可能更難追查污染物的侵害。你所提到的色譜柱問題的根源還可能是由其他污染物如流動相中的灰塵或泵密封墊脫落的碎屑引起。也可能是由流動相中的污染物被吸附引起。上述原因中的其中一些可能很難進行故障排查，而保護柱可以很容易的解決這些問題。
問：還有其他原因可能導致色譜柱壽命縮短嗎？
答：有，但是如果您遵循制造商的建議，則可能性很小。一種可能的原因是由于流動相pH值超出建議范圍而導致色譜柱塌陷。這也可能因樣品溶解在強酸或強堿溶液中引起的。
此外，針對特定色譜柱，這里還有一些小建議。
例如氨基柱會與醛和酮反應。在無緩沖鹽的水溶液中的氨基柱會產生強堿性的pH值，從而導致二氧化硅部分溶解。
當暴露在錯誤的溶劑中時，色譜柱也會塌陷。這是因為色譜柱從根本上來說結構非常松散。它們通過顆粒彼此粘附而部分聚集在一起。當你將它們置于破壞這種粘附力的流動相中時，柱床塌陷的可能性就會增加。這偶爾會發生于在中等極性溶劑中的CN柱或在THF溶劑中的苯基柱上。
這也是避免色譜柱“洗滌”的一個原因。
2. 不斷變化的保留時間
問：我的色譜峰保留時間不固定，這是為什么？
答：首先，我們需要找到這種變化的模式。這將告訴我們很多有關該問題的潛在根源。如果保留時間從一次運行到下一次運行隨機變化，那么我將首先檢查一下泵和溶劑混合裝置。為驗證泵是否正常工作，請使用帶刻度的量筒和秒表來測量流速。為了驗證流動相的組成有無變化，可以向一種流動相溶劑中加入示蹤劑然后觀察基線。如果流動相組成恒定，則基線將穩定。如果成分發生變化，您將在基線中觀察到相應的變化。例如，如果您使用的是帶紫外檢測器的反相色譜法，你可以向有機溶劑中添加0.1％丙酮，并在254 nm處監測基線。或者，您可以手動配置流動相從而繞過溶劑混合設備。如果保留時間的波動消失了，那么問題的根源就是混合設備。
問：同一天不同針之間的保留時間很穩定，但是不同天之間的保留時間不固定。
答：在這種情況下，儀器本身不太可能是罪魁禍首。引起這種變化的最可能原因是流動相組成。在反相色譜中，保留因子k與流動相中有機溶劑的體積分數之間存在指數關系。根據經驗，如果有機溶劑的用量誤差為1％，則保留時間可在5％至15％之間變化，通常約為10％。這意味著您必須非常仔細地測量溶劑的量。最好的方法是按重量而不是按體積制備流動相。
另外，如何給流動相脫氣也可能導致保留時間變化。最好的脫氣方法是同時采用真空和超聲約一分鐘。另一種好的方法是氦氣吹掃。在流動相與氦氣達到初步平衡后，應將氦氣流量調低。否則，氦氣將攜帶溶劑蒸氣，而流動相溶劑組成可能會因此蒸發而發生變化。
如果您的樣品成分是離子型或可離子化的，那么控制流動相的pH值就非常重要。小至0.1pH單位的變化都可能導致保留時間10％的偏移。因此，準確測量pH值并維持pH計校準良好非常重要。在反相系統中，隨著pH值的增加，酸的保留時間縮短，而堿的保留時間延長。
順便說一句，我的化學老師總是說：“緩沖液之所以稱為緩沖液，是因為它應該緩沖pH值。如果不這樣做，就不是緩沖液。”例如，乙酸銨溶液就是乙酸銨溶液。乙酸鹽緩沖液包含乙酸根離子和乙酸。如果緩沖液中它們的存在量相同，則所得的pH值就是緩沖液的pKa值，以乙酸鹽為例其pKa值為4.75。緩沖液總是在溶液pH=pKa時，緩沖能力最強。
問：過去，我沒有意識到需要多么精確地控制流動相組成才能獲得可重現的結果。還有其他必須注意的變量嗎？
答：另一個重要因素是溫度。如果所有峰的保留時間沿同一方向移動，你就可以懷疑是溫度是引起這種波動的原因。經驗告訴我們，溫度每變化每1攝氏度，保留時間將變化約1％至2％。在正常情況下，這變化并不顯著。但在許多地方，周末會關閉暖氣或空調，然后你就會疑惑為什么在周末自動運行的分析顯示的保留時間與在工作日時運行的分析的保留時間不同。顯然，通過使用柱溫箱可有效避免這種情況發生。
在檢測離子型或可電離樣品化合物的反相色譜法中，保留時間還受到緩沖液離子強度的影響，但影響很小，通常可以忽略不計。通常20％摩爾濃度的緩沖液變化對保留時間的影響在在1％以下。因為總是對緩沖鹽進行稱重后配置緩沖液，因此不可能發生如此大的錯誤。
問：還有需要考慮其他參數的特殊情況嗎？
答：是的。在離子對色譜中，離子對試劑的濃度會影響離子樣品組分的保留。與離子對試劑帶相反電荷的分析物的保留時間增加，帶相同電荷的分析物的保留時間減少。中性化合物幾乎不受影響。當離子對試劑濃度低時，即低于5 mM/L，與試劑相互作用的樣品成分的保留時間會隨離子對試劑濃度的變化成比例地變化。當離子對試劑濃度高時，即大約10 mM/L，基團表面被離子對試劑吸附飽和，此時離子對試劑濃度的變化不會導致分析物的保留時間發生明顯變化。
在正相色譜中，保留時間對流動相中極性成分的濃度非常敏感。無論是否想要，這些成分中總是存在的一種是水。因此，水分含量的不同就可能導致保留時間的不同。解決該問題的一種訣竅是使用用水半飽和過的非極性溶劑，如己烷或二氯甲烷。為此，您需要取一定量的此溶劑并通過向其中添加一些水再攪拌一會兒使其飽和，，然后將這種水飽和的溶劑混勻后與等體積的“干燥”溶劑混合。該么操作的結果是非極性溶劑的水含量具有相當好的重現性。它還有助于防止保留時間的漂移，但這是后面部分的主題。
來源：藥事縱橫
