您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2021-08-16 19:10
蛋白多肽類和單抗藥物免疫原性評價主要包括判定ADA 的存在與否、ADA 水平（抗體滴度）、是否具有中和能力、抗體產生比例和發展變化情況等。有多種方法和技術可用于 ADA 檢測。蛋白多肽類和單抗藥物由于給藥劑量大、半衰期長，循環中的高濃度藥物給免疫原性的評估帶來了很大挑戰。另外，可溶性靶標的存在也會給單抗藥物免疫原性檢測帶來較大干擾。如何減少這些干擾，保證檢測結果的準確性、靈敏度、特異性和可靠性是當前 ADA 和 NAb檢測方法亟需解決的問題。本文對常用的 ADA 和 NAb 檢測方法、檢測中存在的問題、已有解決方法及其研究進展進行綜述，為蛋白多肽類藥物和單抗藥物研究開發和應用中免疫原性的評價提供方法參考。
1 ADA 的檢測
ADA 的檢測和表征常采用多層次方法。檢測通常包括篩選試驗和特異性確證試驗；表征試驗一般包括抗體滴度測定、亞型測定和中和抗體檢測。
凍干制劑關鍵技術: 處方工藝研究、工藝放大與驗證及案例分析
ADA 檢測試驗需要兩個關鍵的決策參數，分別為篩選臨界點和特異性臨界點[2]。篩選臨界點即篩選試驗中判斷樣品為陰性或陽性的響應水平[3]，等于或高于篩選臨界點的樣品為陽性樣品。相反地，若低于篩選臨界點，則判斷該樣品為陰性樣品。一個有效的篩選臨界點需要在預研究驗證階段對一系列樣品測定值進行系統性的統計分析，然后才能確定。一般情況下，一定比例的假陽性結果比沒有假陽性結果好，可以允許約 5% 的篩選試驗陽性結果為假陽性，以保證可以檢測出弱陽性樣品。同時，要求所使用的樣品可代表使用目標群體或受試者。特異性臨界點是可以區別抗藥抗體與藥物是否特異性結合的值，其有效性非常關鍵，必須客觀評估。不建議使用 50% 信號抑制等主觀標準，信號略高于臨界點的抗藥抗體弱陽性樣品的評價尤為重要。
抗藥抗體的表征試驗中抗體滴度的測定，一般表示為，能夠產生陽性結果的最低濃度，或者說最大稀釋倍數；亞型測定即檢測抗藥抗體所屬 IgA、IgD、IgE、IgG 以及 IgM 中的哪一種亞型；中和抗體的檢測即為檢測 ADA 中是否有可以中和藥物活性的抗體。
1.1 ADA 檢測分析方法
1.1.1 ADA 檢測常用分析方法
常用方法包括酶聯免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振法（SPR）、電化學發光法（ECL）、全自動納升級免疫分析工作站（Gyrolab）等。
免疫原性篩選通常使用操作方便快捷、能夠高通量測定的 ELISA 方法。橋式 ELISA 方法最為常用，該方法是利用包被在酶標板上的抗體藥物捕獲血清樣品中的 ADA，然后加入生物素標記的抗體藥物，使其與 ADA 結合。接著用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯試劑作為檢測試劑，加入酶反應底物顯色后，再利用酶標儀進行檢測。此法的優點是能檢測各類抗體的亞型，可高通量檢測。但此法不易檢測到低親和力的抗體，在包被或標記藥物時可能會掩蓋或者改變藥物的抗原表位，而且檢測時也容易受到藥物本身的干擾[4-5]。
RIPA 法是以放射性標記的抗原或抗體通過免疫沉淀檢測 ADA。優點是中等或高通量水平，通常靈敏度高、特異性強、操作簡便、樣品及試劑用量少。但缺點是該方法中標記抗原的比活度和放化純度必須足夠高，而且所使用放射性同位素的半衰期也必須足夠長，否則有部分抗體無法被檢測到，導致定量不準。而且同位素具有潛在放射性危害，同位素標記還會影響表位的暴露，標記藥物非特異性地夾帶在沉淀物中，相對于固相表面，結合力較弱。
SPR 技術是將藥物偶聯在傳感器芯片上，其可與樣品中的抗藥抗體結合[6]，使傳感器能夠間接檢測到抗藥抗體，最后通過系統擬合的結合曲線對 ADA 進行定量分析。該方法的優點是可實現實時、無標記檢測，而且快速、靈敏、操作簡便，能檢測到不同親和力的抗體和各抗體亞型；缺點是所用試劑通用性差，通量低。
ECL 是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，可用磁珠或者石墨電極板作為反應載體。將生物素標記的藥物與鏈霉親和素包被的微磁珠或石墨電極板相結合，利用該藥物去捕獲樣品中的 ADA，然后再加入釕標記的藥物，使其與 ADA 結合。形成免疫復合物后，以磁珠為載體的試驗利用磁場吸附磁珠，并用 ProCell（在免疫分析系統中產生電化學信號的系統溶液）溶液將結合了磁珠的免疫復合物與未結合的組分分離，最后施加電壓啟動反應，激發釕發出光信號，通過采集光信號，并將光信號轉化成ADA 濃度，得以實現對 ADA 的定量。而以石墨電極板作為反應載體的試驗，將電極表面通電后，通過電化學作用激發釕標記物發出強光，同樣通過檢測光信號進行 ADA 的定量[7]。ECL 法精密度高、靈敏度高、線性范圍寬、檢測時間短、反應體系可控、樣品用量少、通量高，缺點是需制備 2 種標記物（生物素標記的藥物和釕標記的藥物），需要保證標記物足夠穩定，所用試劑通用性差。
使用 Gyrolab 平臺進行免疫原性檢測，采用自動化進樣方式，將傳統的雙抗夾心大分子檢測方法與微流控 CD技術結合在一起，CD 微結構中裝有鏈霉親和素包裹的微珠填料，通過生物素捕捉試劑，與樣本特異性相結合，再與帶熒光團的檢測試劑結合，用工作站中的激光激發熒光，并用檢測器對吸附在樣本上的熒光標記物進行讀數。該技術已經被廣泛用于生物分析中的配體結合試驗[8]。該技術的優點是自動化、通量高、節省時間、試劑盒樣品用量少、檢測范圍廣、基質效應低。專用的 Gyrolab ADA 軟件還可以幫助確定篩選臨界點和確證臨界點。
1.1.2 ADA 檢測新興分析技術
為滿足越來越嚴格的評價標準的要求，涌現出一些新興 ADA 檢測分析技術。
免疫 PCR 法（Im-PCR），首先將 ADA 與固相上的藥物及生物素化藥物結合，從而形成“藥物-ADA-生物素化藥物”的橋梁，然后加入抗生物素-DNA 復合物作為檢測試劑，通過擴增 DNA，間接對 ADA 進行檢測[9-10]。該方法也是在 ELISA 的基礎上建立起的，用 PCR 擴增代替ELISA 的酶催化底物顯色[11]。PCR 具有很強的放大能力，可以檢測稀釋后的 ADA，不僅可減少基質效應，還具有非常高的靈敏度和特異性。與對應的 ELISA 比較，Im-PCR可使 ADA 檢測的靈敏度提高約 1000 倍，而且本法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質的干擾[11]。
Singulex Erenna 是基于單分子檢測技術（SMC）的免疫檢測系統，原理與傳統的 ELISA 很相似，只是在捕獲和檢測步驟，藥物將每個 ADA 轉化成信號。在洗脫步驟，熒光素標記的檢測抗體從免疫復合物中解離下來，洗脫物被送入 Erenna 系統的毛細管中，毛細管上有一個非常微小的檢測空間可供激光照射。通過檢測空間時，單個的熒光素標記抗體可以產生熒光閃爍，從而被檢測到。SMC 技術在獲得最優化的免疫檢測效力的同時，操作流程相對更為簡便，該技術通過整合獨特的洗脫步驟和靈敏的數字化檢測，相較于傳統免疫檢測技術，信噪比有了很顯著的改善，實現了可以在一個系統里同時檢測低水平和高水平的 ADA。
SQI SquidLite 技術可以在活化的玻璃表面上打印藥物的微陣列斑點[12]，加入待測樣品后，ADA 就會與藥物結合，再用熒光標記的抗體結合 ADA，通過檢測熒光強度對ADA 進行分析。該平臺實現了在同一孔中進行 ADA 及其亞型的檢測，可以避免多次檢測帶來的樣本量的損耗。該技術與 ELISA 或 ECL 相比，有更高的敏感性和耐藥性。它的主要優勢體現在，當需要進行檢測抗體分型時能夠多路復用，自動化系統還具有高通量特性。然而該平臺使用專用緩沖器，前期需要大量成本。
Genalyte Maverick 系統也可以實現同時檢測 ADA 及其亞型。該技術平臺，將藥物捕獲探針印刷在硅光子生物傳感器表面，樣品中的 ADA 會被藥物捕獲，使用結合在鏈霉親和素包被珠上的生物素化藥進行檢測，由于珠子的加入改變了原樣品溶液的折射率，然后根據折射率的變化，就可以測定 ADA[8]。該系統能夠檢測所有免疫球蛋白亞型，包括單價的 IgG4。然而該平臺要求樣品進行酸解離預處理，然后用包被在 96 孔板上的藥物親和捕獲 ADA，ADA 要在低 pH 下洗脫和中和。SQI SquidLite 技術和 GenalyteMaverick 系統均有可自動化的優勢，但是后者不需要標記，而且可以進行實時動態讀取結果，而前者只有最終的結果讀數，并且目前使用較少。
1.2 ADA 檢測中主要干擾因素及解決方法
1.2.1 樣品基質中循環藥物的干擾及解決方法
免疫原性檢測，會受到樣品基質中循環藥物的干擾，過量的藥物與ADA 結合，會造成 ADA 檢測假陰性結果。目前 ADA 分析中有多種方法來提高藥物耐受性，減少或避免由于游離藥物的存在造成的假陰性結果，防止對 ADA 的低估。
由于 ADA 在樣品中會有兩種存在形式，即游離 ADA和 ADA-藥物復合物[13]。游離的 ADA 相對比較容易檢測到，想要同時檢測與藥物結合的 ADA，單獨利用上述某一種方法或技術平臺難以實現。為了克服 ADA 檢測過程中受到的各種干擾，需要對樣品進行預處理，目前主要的預處理方法有吸附小柱去除游離藥物、酸解離或堿解離（絕大多數情況下為酸解離）、磁珠提取和酸解離（BEAD）、固相提取和酸解離（SPEAD）等方法。
1.2.1.1 吸附小柱去除游離藥物
吸附小柱可與藥物特異性結合的物質（抗人 IgG 單克隆抗體或多克隆抗體）與固相載體（瓊脂糖樹脂、磁性顆粒、芯片或微流體）偶聯，該物質不與樣品中除游離藥物之外的其他成分反應，可特異性地結合待測樣品中的游離藥物，可以使其后的 ADA 檢測中（如使用橋接 ELISA 法）避免游離藥物與標記試劑競爭結合待檢測的 ADA 所致的干擾，包括對 ADA 檢測的低估或假陰性結果[14]。這個方法不僅有效地減少了藥物對抗藥抗體檢測的干擾，同時還提高了檢測靈敏度。但該方法只是去除樣品中游離的藥物，而已經與 ADA 結合的藥物難以去除，藥物-ADA 復合物依舊會影響檢測結果。
1.2.1.2 酸解離
酸解離是較為常見的預處理手段[5]。具體地說，酸解離是通過酸化樣品來實現將 ADA-藥物復合物解離成 ADA 和藥物，但這僅是在酸性條件下的存在形式，酸化后的樣品需要在 pH 回到中性時方可被用于 ADA 的檢測。此時，樣品中的部分藥物和抗藥抗體又重新形成ADA-藥物復合物。而且，酸處理可以分解藥物-靶點復合物，可能會將游離靶點釋放到樣品基質中，導致假陽性結果。但酸解離的最大目的是使得原來已與藥物結合的抗藥抗體至少有部分可以被檢測到，如果不采用酸解的話，可能檢測不到 ADA。在使用酸解離處理樣品的 ECL 檢測方法中，即使酸化后樣品中的抗藥抗體在中性 pH 條件下，僅僅只有部分會同時與電極板微孔中生物素化的藥物以及釕標記的藥物結合，但仍然可被檢測出來。在所用酸解試劑不影響ADA 性質的前提下，此方法簡單，易操作。
1.2.1.3 BEAD 和 SPEAD
BEAD 法與 SPEAD 法原理相似，兩者均是在載體上包被鏈霉親和素以結合生物素-藥物偶聯物，差別在于 BEAD 法提取 ADA 的載體是磁珠，SPEAD 法提取 ADA 的載體是鏈霉親和素包被的石墨電極板或酶標板[15-18]。在這兩種方法中，藥物-ADA 復合物在低 pH 條件下解離，當溶液中和后，加入生物素-藥物偶聯物，與游離藥物競爭結合 ADA，生物素-藥物偶聯物與ADA 結合后被捕獲在鏈霉親和素包被的載體（磁珠或板）上。捕獲的 ADA 再次在低 pH 條件下處理洗脫，然后進行檢測。相對而言，SPEAD 法具有操作簡單和材料價格較低的優勢，但與磁珠相比，板的結合能力相對較低。根據本實驗室經驗，同樣條件下，BEAD 法得到的檢測結果相對穩定，易重復。
1.2.1.4 沉淀和酸解離
Zoghbi 等[19]開發了一種突破性的新方法，即采用沉淀和酸解離（PandA）相結合的方法來克服 ADA 檢測中的藥物干擾。該方法的原理是將過量的藥物添加到含 ADA 的血清樣品中并孵育，以形成 ADA-藥物復合物。初次孵育后，在樣品中添加 PEG 并孵育以使復合物沉淀。對沉淀進行一系列洗滌，最后一次洗滌后，將沉淀用乙酸解離，使 ADA-藥物復合物解離成 ADA 和藥物，并直接包被到石墨電極板上。孵育后，將板封閉，然后加入釕標記的藥物與包被的 ADA 結合，通過 ECL 方法對ADA 進行檢測。在他們的方法中，分別使用了人源化IgG1、全人源 IgG4 和人源化 IgG4 單抗藥物進行實驗，均證明了該方法的適用性。然而本實驗室在實際應用該方法時發現，由于操作步驟較多，分離沉淀和上清液難度也較大，而 PEG 的濃度也會影響靈敏度和特異性，因此不確定因素較多，導致重復性較差。
1.2.2 基質中可溶性靶標的干擾及解決方法
對于單抗藥物，可溶性靶標的干擾也是一個特別具有挑戰性的問題。可溶性的二聚體或多聚體藥物靶標可以在兩個標記藥物分子之間形成橋梁，容易導致 ADA 假陽性結果。
單克隆抗體藥物 ADA 檢測中，對于可溶性靶標的干擾問題，目前通常采用的解決方法是將基質中的可溶性靶點進行清除，通常可以用靶點抑制劑（一般為相應的抗靶點抗體）去結合靶點，可去除靶點的干擾作用，提高靶點耐受性[20]。
1.2.3 基質中類風濕因子的干擾及解決辦法
類風濕因子（RF）是以變性的 IgG 的 Fc 片段為靶抗原的自身抗體，RF 不僅可與變性的 IgG 結合，也與自身 IgG 或異體 IgG反應，常對免疫檢測造成干擾。在檢測 ADA 時，如果用的捕獲抗體和檢測抗體均為 IgG，樣本基質中的 RF 能同時與二者結合，形成捕獲抗體-RF-檢測抗體復合物，從而產生 ADA 假陽性。而當 RF 只能與其中一種抗體結合時，又會造成空間位阻，導致假陰性結果的產生。對于存在 RF干擾的樣本，可通過對樣本進行前處理以消除或盡可能降低其干擾。常用的方法包括：分析前在樣本中加入動物血清或IgG，或加入封閉阻斷試劑；用包被 IgG 的固體顆粒吸附；使用阻斷試管采集樣本等[21]。
前文所述的檢測方法和平臺多數都較為傳統，通常都是在前處理過程中將 ADA-藥物復合物分開，然后單獨檢測ADA。是否可以實現在 ADA-藥物復合物不分開的情況下檢測 ADA，值得進一步探究。
2 NAb 的檢測
藥物的中和抗體指能夠中和藥物活性的抗藥抗體，單抗藥物的中和抗體是與單抗互補決定區（CDR）特異性結合的抗藥抗體[22]。在某些情況下，NAb 還可以與內源性對應物發生交叉反應，從而導致一些正常生理功能受損和危及生命的副作用。因此 NAb 的表征已經成為評估生物技術藥物安全性和有效性的重要要素。
2.1 NAb 檢測方法
NAb 檢測通常分為兩類：基于細胞的分析檢測（CBA）和競爭性配體結合分析檢測（CLBA）[23]。CBA 方法使用表達藥物預定靶點的細胞，樣品中的 NAb 阻止了藥物與其靶點結合產生的細胞效應，從而根據細胞效應減弱的程度進行 NAb 分析；CLBA 方法是通過評價可溶性靶點和樣品中NAb 對藥物的競爭性結合，再結合 ELISA 或 ECL 平臺進行 NAb 檢測。
對于 NAb 檢測，監管機構推薦基于細胞的分析檢測作為首選方法，因為細胞反應更能反映 NAb 在體內對藥物的影響[3]。抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）是一種常見的治療性抗體藥物的作用機制。Wu 等[23]建立、優化了一種基于 ADCC 的 NAb 檢測方法，用該方法來檢測貝那利珠單抗給予人后誘導的 NAb。其原理是貝那珠單抗與靶細胞上的人 IL-5R 結合，并且貝那珠單抗的 Fc 區通過CD16 與效應細胞結合，從而誘導靶細胞的 ADCC。ADCC活性與熒光素酶報告基因的激活密切相關。在含有 NAb 的血清樣品中，ADCC 就會被 NAb 抑制，導致熒光素酶信號（RLU 值）降低。產生的熒光素酶信號與樣品中存在的NAb 數量成反比。雖然該方法藥物耐受性和靈敏度都不是很高，但用于檢測臨床樣本是可行的。
美國瑞澤恩制藥公司發明了用于檢測中和抗體的競爭性配體結合法[24]，該方法簡單來說包括以下步驟，首先要獲取樣品，然后在捕獲試劑（一般為生物素標記的治療性蛋白藥物）存在下孵育樣品，最后加入檢測試劑。其中相對于對照樣品降低的信號指示針對蛋白多肽或單抗藥物的中和抗體存在。該方法靈敏度較高，特異性較強，動態范圍較廣，檢測時間較短，有相對更高的藥物耐受性。
Wu 等[23]曾通過檢測貝那利珠單抗的中和抗體對比了CBA 與 CLBA 兩種方法在檢測 NAb 時精密度、靈敏度以及藥物耐受性等方面的差異。CLBA 與 CBA 批內變異相當，與 CBA 相比，CLBA 批間變異相對小得多，因此CLBA 比 CBA 精密度更高。CLBA 對單克隆 ADA 陽性對照及多克隆 ADA 陽性對照的檢測靈敏度也相對較高。另外，盡管兩種方法的藥物耐受性都是有限的，但 CLBA藥物耐受性約為 2.5 倍（可檢測到的 NAb 濃度與藥物濃度比），而 CBA 則只有 1.6 倍，因此 CLBA 藥物耐受性同樣相對較高。Hu 等[25]在 3 項臨床研究中也進行了 CBA和 CLBA 法的對比，其中兩項研究結果表明 CBA 和CLBA 檢測中和抗體的能力相當，在第三項研究中，CLBA表現相對較差。由此可見，無論是 CBA 還是 CLBA，都有自身的優勢和局限性，應根據每一種藥物獨特的作用機制、免疫風險評估以及技術可行性評估去選擇和設計 NAb檢測方法。
2.2 NAb 檢測中常見的干擾因素及解決辦法
在 CBA 分析中，同樣存在著樣品基質對檢測的干擾，樣本基質中高濃度的循環藥物可與 NAb 結合，并導致假陰性結果；樣品基質中的可溶性靶點與藥物結合，阻止了藥物介導的細胞依賴的生物活性作用，導致產生假陽性結果。而在 CLBA 分析中，游離的可溶性靶標可以阻止標記的靶標與檢測板上包被的藥物結合，從而產生假陽性結果。
為了避免假性結果的出現，可采用各種方法來減輕循環藥物及可溶性靶點對 NAb 分析的干擾。用于解決 ADA 檢測干擾問題的預處理方法同樣適用于 NAb 的檢測，例如酸解離、循環藥物的去除、從樣品基質中分離 ADA 或使用抗靶點抗體抑制藥物靶點等，但有些方法的一些步驟需要進行改進，如 SPEAD 和 BEAD 方法，以更有利于 NAb 的檢測。
在 SPEAD 或 BEAD 中，在低 pH 下，鏈霉親和素包被的磁珠上結合的生物素-藥物結合物由于結合能力降低可能會發生一定程度的浸出，盡管通常來講生物素-藥物的浸出對 ADA 分析沒有明顯影響，但浸出的生物素-藥物會與 NAb 結合，可能干擾 NAb 檢測，影響分析結果。可通過優化所用洗脫溶液的 pH、生物素摩爾比以及孵育時間等實驗條件，解決生物素-藥物結合物浸出問題[15]。
3 結語
在生物技術藥物的安全性和有效性的評估中，免疫原性一直是非常重要的評價內容[26]，ADA 檢測方法缺乏標準化是免疫原性評價的一大問題[27]。高濃度循環藥物的干擾，是當前 ADA 與 NAb 檢測面臨的主要問題。對于單抗藥物而言，可溶性靶標也會對檢測產生干擾，這些都會直接影響檢測結果。目前主要的方法是進行酸解或磁珠提取等預處理，或者將不同預處理方法相結合。在研究中，應該考慮每種藥物的特點、檢測目的、風險評估、靈敏度目標、操作難易程度及可行性等，選擇適用的分析方法和平臺。
近年來，不同的免疫原性分析方法在靈敏度和耐藥性方面有了大幅提高，并且在持續完善。隨著免疫原性評價技術的不斷進步，相信將有更加優化的方法出現，用于準確評價蛋白多肽類和單抗藥物的免疫原性。
作者｜王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會芳
內容來源｜中國醫藥生物技術 2021.06
作者｜王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會芳
內容來源｜中國醫藥生物技術 2021.06
來源：中國醫藥生物技術
