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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-17 20:08
摘 要： 建立一種基于三維熒光技術(shù)與化學計量學方法的分析模型，同時快速測定桃仁多組分。采集不同桃仁品種及偽品的三維熒光光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合化學計量學方法建模分析。桃仁以及偽品的鑒別，在預(yù)實驗中的綜合準確率良好；桃仁中的苦杏仁苷含量、羰基值2個指標，線性回歸算法的回歸決定系數(shù)R2分別為0.808 3、0.769 8；非線性回歸算法苦杏仁苷含量的回歸決定系數(shù)R2為0.995 1。該方法在靈敏度、特異性、多組分同時測量等方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，可以對桃仁多組分同時快速分析。
關(guān)鍵詞： 桃仁； 三維熒光技術(shù)； 化學計量學方法； 快速分析
桃仁為薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種子。果實成熟后采收，除去果肉和核殼，取出種子，曬干。味苦、甘，性平，歸心、肝、大腸經(jīng)。具活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘之功，用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，肺癰腸癰，跌撲損傷，腸燥便秘，咳嗽氣喘[1?3]。桃仁入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)·卷三》[4]，從古至今已入藥千年。桃仁中含有多種化學成分，主要包括揮發(fā)油類、氰苷、氨基酸和蛋白質(zhì)類、黃酮及其苷類、甾醇及其苷類、芳香苷類、脂肪酸類、苯丙素類、核苷、微量元素以及其他類化合物[5?7]。桃仁的主要藥理活性包括預(yù)防肝纖維化和抗氧化、抗炎、抗血栓、抗凝血等，在抗炎和抗癌、活血化瘀以及婦科疾病和神經(jīng)保護等方面有廣泛的應(yīng)用[6]。桃仁在臨床上常與多種藥物配伍使用，與紅花、當歸等藥物同用治療痛經(jīng)；與火麻仁、柏子仁等藥物同用治療腸燥便秘；與杏仁等藥物同用治療咳嗽、氣喘等。
桃仁是2022年安徽省國家評價性抽檢品種，通過調(diào)研藥材市場和相關(guān)生產(chǎn)廠家，發(fā)現(xiàn)桃仁在市場儲存中極易發(fā)生變質(zhì)[8]，羰基值、水分、含量測定（苦杏仁苷）等藥典參數(shù)容易受到包括品種、環(huán)境、產(chǎn)地、收獲時間、處理方法等因素的影響，從而導致藥材或飲片質(zhì)量不合格。其次桃仁化學成分復雜，含有多種化學成分，這些成分在桃仁中以不同的比例和方式存在，使得其化學成分研究變得復雜。目前針對桃仁的研究大部分還是集中在不同成分含量以及藥理方面，如何對桃仁多組分快速分析上研究得甚少，因此為了對桃仁的質(zhì)量進行快速地檢驗，并加以控制，很有必要建立一套快速的定性與定量檢驗方法。通過定性分析，可以進行真?zhèn)舞b別，全面描述熒光特性；通過定量分析，可以精確測定成分含量，提升質(zhì)量控制，支持藥效研究。基于該次國評抽檢的全覆蓋性、多樣性以及樣本量大等優(yōu)點，契合了快檢模型大數(shù)據(jù)的特性，為建立控制桃仁質(zhì)量的快檢方法奠定了基礎(chǔ)。
三維熒光光譜是20世紀80年代在熒光光譜分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分析技術(shù)[9]，三維熒光光譜是指將熒光強度以等高線方式投影在以激發(fā)光波長（Ex）和發(fā)射光波長（Em）分別為縱、橫坐標的平面上獲得的譜圖，圖像直觀，所含信息豐富[10?11]。三維熒光圖譜包含激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光強度 3 種信息，描述了熒光強度隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系[12?13]。三維熒光光譜能夠比二維熒光光譜更有效地反映熒光光譜信息，它不僅可以提高測量靈敏度和對分子結(jié)構(gòu)的選擇性，而且能夠更加全面地展現(xiàn)樣品的熒光信息，有利于綜合考察樣品的組分分布及構(gòu)型變化特征[14]。此外，將其與化學計量學結(jié)合應(yīng)用，大大簡化了操作步驟，省時省力，可以更簡便、快速地從復雜組成的樣品中靈敏、可靠地檢測到一些痕量成分，提高了熒光光譜分析的靈敏度和選擇性[14]。目前三維熒光技術(shù)與化學計量學方法結(jié)合在中藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[15?17]，然而對桃仁的快速檢驗研究中作者未見其在三維熒光技術(shù)與化學計量學方法結(jié)合這一研究方向上有所涉及，因此對《中國藥典（2020年版）一部》收載的桃仁及其飲片開展三維熒光技術(shù)結(jié)合化學計量學建模分析，借助其高靈敏度、多組分同時定量分析的能力，提高桃仁研究的深度和廣度，也為中藥現(xiàn)代化研究提供了新的思路和方法。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
三維熒光光譜儀：FT-7000，日本日立公司。
化學計量學建模軟件：Model Lab Specman3D，科邁恩（北京）科技有限公司。
分析天平：BSA124S，感量為0.1 mg，梅特勒賽多利斯儀器（中國）有限公司。
數(shù)控超聲波清洗器：KQ-800DE型，昆山市超聲儀器有限公司。
苦杏仁苷：含量（質(zhì)量分數(shù)）為88.20%，批號為110820-201808，中國食品藥品檢定研究院。
甲醇：分析純，廣東光華科技股份有限公司。
實驗室用水為蒸餾水。
實驗樣品：桃仁及其炮制品共計30個批次，炮制工藝的燀桃仁共計30個批次，苦杏仁共計6個批次，均由安徽省食品藥品檢驗研究院提供并鑒別，具體信息見表1。
表1 桃仁及其炮制品
Tab. 1 Peach kernel and its processed products
1.2 儀器工作條件
1.2.1 熒光光譜儀
激發(fā)波長：200～600 nm，帶寬為5 nm；發(fā)射波長：250～650 nm；帶寬：5 nm；光電倍增二極管（PMT）電壓：600 V。
1.2.2 化學計量學建模軟件
背景扣除：拉曼散射及瑞利散射帶寬為30 nm，插值算法為3次樣條（Spline）采樣；因子分解算法：ATLD交替三線性分解算法，預(yù)估組分數(shù)為10；機器學習建模算法：k重交叉驗證（k=7）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘回歸（PLSR）、隨機森林（RF）等。
1.3 實驗步驟
1.3.1 樣品溶液的制備
移取樣品（過二號篩）約0.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲波提取20 min，放冷，加甲醇至標線，搖勻。精密量取上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水至標線，作為樣品溶液，使用時加以稀釋。
1.3.2 樣品的測定
將樣品溶液置于比色皿中，放置于熒光光譜儀中進行測定。每個樣品連續(xù)測定3次，合計198組樣品數(shù)據(jù)，將CSV格式三維熒光光譜數(shù)據(jù)批量導入Model Lab Specman3D化學計量學建模軟件進行數(shù)據(jù)處理及機器學習建模分析。
按照實驗研究內(nèi)容，對樣品數(shù)據(jù)分別進行分組（桃仁組、山桃仁組、苦杏仁組、燀桃仁組、炒桃仁組），并在每個分組中隨機挑選20%的樣品作為外部驗證集，與交叉驗證集一同對建模質(zhì)量（模型泛化程度）進行評價。
2. 結(jié)果與討論
2.1 桃仁藥材基源鑒別分析
2.1.1 用PCA主成分析降維分析桃仁基源及偽品
4種桃仁樣品PCA主成分析得分見圖1。
圖1 桃仁樣品PCA主成分析得分圖
Fig. 1 PCA principal component score plot of peach kernel samples
采用PCA算法分析不同藥材基源的桃仁及摻偽品差異，當前2個主成分解釋自變量總方差大于90%，作為無監(jiān)督的降維方法，結(jié)果顯示桃仁和山桃仁的三維熒光差異非常顯著（圖1a），因此在后續(xù)分析均對兩類桃仁進行區(qū)別對待，否則容易導致建模模型過擬合。
采用PCA算法分別對燀桃仁、炒桃仁飲片樣品進行分析，結(jié)果顯示燀桃仁（桃仁、山桃仁）兩類存在較大差異（圖1b），而炒桃仁（桃仁、山桃仁）兩類差異不明顯（圖1c）。采用PCA算法對正品桃仁及常見摻偽品（苦杏仁）進行差異分析。
當前2個主成分解釋自變量總方差大于83%，作為無監(jiān)督的降維方法，試驗結(jié)果顯示，桃仁、山桃仁和杏仁的三維熒光差異非常顯著，且杏仁樣品的主成分投影遠離桃仁和山桃仁。
2.1.2 運用PLS-DA算法判別桃仁炮制品之間的區(qū)別
采用有監(jiān)督的偏最小二乘PLS-DA判別對不同分組（實際分組和預(yù)測分組）進行分析。
模型對于區(qū)分不同植物基源的桃仁和燀桃仁具有較好的預(yù)測率，交叉驗證和外部驗證集的識別率均達到100%。而炒桃仁的識別率為91.6%，與PCA分析趨勢一致，有監(jiān)督算法，結(jié)果較優(yōu)。
2.2 定量模型的研究
2.2.1 運用PLSR回歸分析算法建立定量模型
采用PLSR偏最小二乘回歸分析方法同時對桃仁樣品中的苦杏仁苷含量、水分、羰基值、酸值4個指標進行分析，統(tǒng)計結(jié)果見表4。
表4 桃仁樣品PLSR回歸方程及統(tǒng)計結(jié)果
Tab. 4 PLSR regression equation and statistical results for peach kernel samples
2.2.2 運用隨機森林回歸分析算法建立定量模型
采用隨機森林回歸選擇方法對苦杏仁苷含量進行回歸分析，統(tǒng)計結(jié)果見表5。
表5 桃仁樣品RF回歸方程及統(tǒng)計結(jié)果
Tab. 5 Random forest regression equation and statistical results for peach kernel samples
3. 結(jié)論
綜合上述三維熒光技術(shù)結(jié)合化學計量學建模的快檢方法對于中藥材桃仁及其飲片質(zhì)量分析的探索性研究工作，初步可歸納為以下幾點：
（1）通過三維熒光光譜智能定性建模分析，對于不同桃仁品種的原藥材鑒別、燀法飲片鑒別，以及炒制飲片在預(yù)實驗中的綜合準確率分別為100%、100%和91.6%。其中前兩者的差異顯著且結(jié)果重現(xiàn)性較好。也提示在炒制過程中，桃仁和山桃仁組分變化有表現(xiàn)出趨同的趨勢。
（2）通過三維熒光光譜智能定量建模分析，對于不同桃仁品種中的苦杏仁苷含量、羰基值、酸值、水分4個指標進行回歸分析，線性回歸算法（PLSR）的回歸決定系數(shù)R2分別為0.808 3、0.769 8、0.120 3、0.185 5；非線性回歸算法（RF）苦杏仁苷含量的回歸決定系數(shù)R2為0.995 1。結(jié)果表明，苦杏仁苷分子擁有苯環(huán)共軛體系，具有熒光特征，但熒光強度較弱。在不采用對照品的情況下通過間接測定的方法，線性回歸決定系數(shù)約為0.8，非線性決定系數(shù)大于0.995，滿足快檢初篩的要求；對水分、酸值兩個指標的間接回歸結(jié)果基本無效（R2≈0.2），說明樣品的熒光組分指紋圖譜中不包含有關(guān)水分和酸值的線性關(guān)系，不宜采用間接測定方法，可考慮引入熒光增敏試劑。
（3）建立桃仁快速篩查模型，能夠迅速對桃仁樣品進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)摻假、變質(zhì)等情況，保障市場上桃仁質(zhì)量。該研究因時間、經(jīng)費等因素影響，對不宜采用間接測定方法的水分、酸值兩個指標沒有開展進一步的研究，因此在未來研究中，可以采用熒光增強技術(shù)，添加適宜的增敏試劑，對桃仁中水分、酸值兩個指標進行檢測，擴大桃仁快速篩查模型的覆蓋面，實現(xiàn)精確和靈敏的定量。
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來源：化學分析計量
