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以樹脂為載體，使用固相合成技術合成多肽類藥物的技術現如今已經得到了廣泛的應用，如固相合成GLP-1類似物索馬魯肽、利拉魯肽。相比于液相合成多肽，固相合成有其顯著的優點：可以使用過量的物料進行反應，通過簡單的對肽樹脂洗滌除去過量的物料，副產物，避免了中間復雜的后處理純化過程，提高效率；可以通過不同的保護基對側鏈保護，選擇性脫除，最后實現對肽鏈的選擇性修飾，如Fmoc策略中使用Mmt、Alloc、ivDde對Lys氨基側鏈進行保護，可以使用對應的HCl、四三苯基膦，水合肼選擇性脫除側鏈保護，最后對氨基進行修飾得到修飾肽。今天我和大家介紹一下氨基酸偶聯步驟中使用的縮合劑以及使用時的注意事項

HOXT/DIC縮合體系

碳二亞胺型縮合體系，出于成本考慮通常使用HOBT/DIC，HOAT/DIC活性更高，抑制消旋作用更強但價格稍貴。有時為了防止HOBT爆炸，會使用水合HOBT，但實際上使用干的HOBT從未有報道過發生爆炸的情況。這套縮合體系使用最廣泛，因為此套體系成本低，活化過程中沒有堿的參與，可以更好的抑制消旋。值得注意的是Cys在堿性條件下活化時（如HXTU/DIPEA，PyXop/DIPEA等）特別容易消旋，因此推薦使用HOXT/DIC活化。以HOBT為例，活化機理見圖a。

圖a

氨基酸先和DIC生成氧酰基異脲中間體，之后和HOXT迅速反應生成氨基酸的HOXT活化酯（如果沒有HOXT，氧酰基異脲中間體會緩慢轉化成無反應活性的N-酰基異脲，見圖b），高活性的活化酯與氨基縮合成酰胺。活化過程中會有脲副產物生成，如活化時間過長，會觀察到活化體系變渾濁就是脲副產物析出，最后可以通過使用DMF洗滌樹脂除去。

圖b

使用配方：AA/HOBT/DIC=1/1/1

操作步驟：氨基酸和HOBT溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIC活化，活化完成后把活化液加入固相反應器反應。

HXTU/DIPEA縮合體系

脲鹽型縮合劑，通常HBTU，HATU配合三級胺一起使用。這套活化體系反應活性優于HOBT/DIC體系。一般情況下第一次偶聯反應不完全的情況下可以考慮使用HXTU/DIPEA縮合體系。以HATU為例，活化機理見圖c。

圖c

這里需要注意一個副反應，過量的HXTU在堿性條件下會和氨基組分反應發生胍基化副反應，使肽鏈封端。機理見圖d。產生此副反應的原因是HXTU使用過量，導致剩余的HXTU與氨基反應，因此投料時控制HXTU的量不超過氨基酸的量；或者HXTU沒有與氨基酸的羧基反應完全就加入固相柱反應，因此偶聯前需要充分活化以避免未消耗的HXTU與氨基發生副反應。

圖d

使用配方：AA/HXTU/DIPEA=1:1:2，有時可以在其中添加HOXT，如

AA/HXTU/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但沒有明確的證據表明添加HOXT能夠提高反應效率或者減小消旋。

操作步驟：氨基酸和HXTU溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反應器反應。

PyXop/DIPEA體系

磷鹽型縮合劑，常用PyBop，PyAop配合三級胺一起使用。高效活化體系，一般情況下第一次偶聯反應不完全的情況下可以考慮使用PyXop/DIPEA縮合體系。比起HXTU/DIPEA，這個偶聯劑不會引起類似的氨基封端反應，因此在固相合成中更加受歡迎。但是質量差的或存放時間長的PyXop中吡咯的含量會增加，活化時會使氨基酸羧基封端生成吡咯酰胺，失去反應活性。機理見圖e

圖e

商業購買的PyBop會殘留一些吡咯烷，對于固相反應來說雖然會導致活性氨基酸的當量下降，但吡咯酰胺衍生物不會引入到肽鏈中，因此副反應在固相合成影響不大，但是液相合成或頭尾環化會產生影響。可以通過再結晶的方法將膦鹽中的吡咯烷副產物從受影響的物質中除去，從而有效地抑制了上述副反應。

使用配方：AA/PyXop/DIPEA=1:1:2，有時可以在其中添加HOXT，如

AA/PyXop/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但沒有明確的證據表明添加HOXT能夠提高反應效率或者減小消旋。

操作步驟：氨基酸和PyXop溶于工藝選定的溶劑中，控溫下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反應器反應。

DEPBT/DIPEA 體系

磷酸酯型縮合劑，也稱作葉蘊華試劑。反應活性高，抑制消旋作用優于HXTU/DIPEA或PyXop/DIPEA體系，特別能夠抑制His的消旋。活化機理見圖f

圖f

Oxyma/DIC 體系

2-肟氰乙酸乙酯，使用方法和HOXT一樣，抑制消旋的能力更強。不同的是Oxyma比HOXT酸性更強，因此可以抑制脯氨酸引起的二肽反應。脯氨酸氨基為二級胺，結構與哌啶類似，并且其二級胺的pKa=10.6，高于普通氨基酸pKa 8.9–9.8，在偶聯脯氨酸后面的氨基酸時，裸露的二級胺可能會使Fmoc-保護氨基酸活化酯提前脫除Fmoc，與另一分子Fmoc-保護氨基酸活化酯縮合生成Fmoc-保護二肽活化酯，最終導致插入肽雜質生成。Oxyma酸性強，能夠抑制脯氨酸二級胺的堿性，抑制此副反應

小結：

目前應用最多的縮合體系是HOXT/DIC，雖然活性不如HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA，但是由于活化沒有堿的參與，消旋的情況會少一些。一般情況下第一次偶聯使用HOXT/DIC，如果反應不完全的話再使用HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA等高效活化體系復投。除了上述的幾種常用縮合劑之外，還有很多新型縮合劑，他們在提高偶聯效率，抑制消旋的方面表現突出。如新型脲鹽型縮合劑中HATU的衍生物HCTU、HDTU、TDBTU，脲鹽和Oxyma結合得到TOTU、HOTU、COMU等。見圖g

圖g