隨著耐抗生素的“超級細菌”的出現，抗生素的耐藥性引起了人們的廣泛關注。在抗生素的選擇性壓力下，具有耐藥性的致病菌大量繁殖，并在宿主（動物或人體）之間傳播，最終會對人類健康形成巨大威脅。為了對抗多重耐藥細菌，人們大力發展除小分子抗生素以外的其他抗菌藥物，其中模擬宿主防御肽（HDP）結構特點的陽離子兩親聚合物具有廣譜高效的殺菌效果和相對于抗菌肽更低的成本，是一種極具前景的新型抗菌藥物。HDP 模擬聚合物通常是具有一定比例的陽離子和疏水側基的無規共聚物，具有抗菌活性的陽離子基團促進聚合物與陰離子細菌細胞膜的初始結合，疏水基團則插入膜內導致細胞裂解和細菌死亡。因此，系統地調整聚合物的分子結構，分子量以及陽離子/疏水基團的比例，對于最大限度地提高 HDP 模擬聚合物的抗菌性能同時最大限度地降低其生物毒性至關重要。然而，已開發的HDP 模擬聚合物往往在生理條件下長期保持化學穩定，持續存在低于最小抑菌濃度（MIC）的抗菌聚合物會對細菌施加選擇性進化壓力，最終可能誘發細菌耐藥性；同時也可能會對人體產生長期毒性以及引起免疫反應。因此，研究出一類具備生物分子觸發的可降解性和降解前后良好生物相容性的抗菌聚合物是十分有必要的。
近期，華南理工大學前沿軟物質學院（華南軟物質科學與技術高等研究院）唐雯研究團隊通過氨基官能化硫辛酸的開環聚合反應，合成了一系列谷胱甘肽觸發的可生物降解的聚二硫化物，該類聚合物具有出色的抗菌活性。同時，作者系統地調整了聚二硫化物的分子量和陽離子/疏水基團的平衡，以最大限度地提高對人體細胞的選擇性殺菌能力。該類聚合物的抗菌活性可以通過谷胱甘肽觸發的降解來關閉。該研究以題為“Glutathione-triggered biodegradable poly(disulfide)s: ring-opening copolymerization and potent antibacterial activity”的論文發表在《Polymer Chemistry》上。本文第一作者是華南理工大學前沿軟物質學院博士生郭佳，通訊作者是華南理工大學前沿軟物質學院唐雯副教授。
在本工作中，作者通過陰離子開環聚合的方法合成了氨基官能化的聚二硫化物（圖1 A）。同時，調整例如單體濃度和投料比等反應條件，可得到具有可控分子結構的一系列均聚物。圖1 B展示了單體與聚合物的核磁結果。均聚物的分子量與分子量分布隨反應條件的變化情況如圖1 C-E所示。
圖1. 氨基官能化的聚二硫化物開環聚合的合成與表征。(A) 合成路線圖；(B) 聚二硫化物1 (P1) 和單體1 (M1) 在CDCl3中的 1H NMR 譜；(C) Mn 和 ? 與初始單體濃度 ([M1]0) 的關系圖；(D) Mn 和 ? 與單體1和引發劑的比率 ([M1]0: [I]0) 的關系圖；(E) 制備型 GPC 純化后，具有不同數均聚合度的P1的GPC結果。
對于抗菌聚合物，陽離子/疏水基團比例的優化對于提升其抗菌性能以及選擇性十分重要。基于此，作者進一步合成了含有疏水側基的陽離子兩親聚二硫化物的無規共聚物，圖2 A證實了共聚物的成功合成。如圖2 B-D所示，通過控制兩種單體M1與M2的投料比，可以高效的合成出分子量與分子量分布接近、聚合物中兩種側基比例可控的無規共聚聚二硫化物。
圖2 通過陽離子單體 (M1) 和疏水單體 (M2) 的共聚，合成陽離子疏水兩親聚二硫化物，其陽離子和疏水基團的平衡可通過調整投料比來控制。(A) 共聚物 P3-50% 的 DOSY NMR 譜圖；(B) Mn 和 ? 與 M1 和 M2 比率([M1]0 : [M2]0) 的關系圖；(C) 脫保護前共聚物 中 M1 和 M2 的比率與初始投料單體比率（[M1]0：[M2]0） 的關系圖；(D) 制備型 GPC 純化后，具有不同疏水重復單元比例（50%、33% 和 25%）的共聚物的 GPC 結果。
已有研究者表明富含胍的聚二硫化物在還原環境中會快速降解。本文中，作者聚焦于谷胱甘肽（GSH）對聚二硫化物的響應性降解，結果表明在生理環境（pH = 7.4）或細菌感染部位的典型微環境（pH = 5）下，均聚以及共聚的氨基官能化的聚二硫化物可以在5分鐘內實現快速降解（圖3 A）。同時，作者也探究了該類聚二硫化物在37 ℃ 下的降解動力學。圖3 B 表明，當初始GSH的濃度（[GSH]0）遠小于聚合物中重復單元的濃度（[RU]0）時，降解速率Rdp = kdpapp [GSH]1，kdpapp = 0.23±0.02 s-1。
圖3 GSH引發的聚二硫化物的降解。(A) P2-55在 37 ℃，pH = 5.0 的條件下， GSH 在 D2O 中處理5分鐘前后的 1H NMR 譜圖；(B) P2-45與不同濃度的 GSH 在 37 ℃， pH = 7.0 的條件下聚合物解聚的散點圖。
作者隨后對脫保護后的氨基官能化陽離子聚二硫化物P2以及含疏水基團的隨機共聚物P4進行了抗菌性能研究，并將含不同聚合度的P2以及含不同疏水基團比例的P4的最小抑菌濃度（MIC）匯總在圖4 A與B中。結果表明所有的聚合物均顯示出對革蘭氏陽性（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性（大腸桿菌）細菌的有效體外抗菌能力，并且被GSH降解的 P2 (DP = 1) 具有低得多的抗菌活性，實現了對聚二硫化物殺菌能力的可控調節。此外，作者也通過熒光共聚焦顯微鏡觀察了聚二硫化物處理2小時后的活死細菌的染色情況，結果顯示實驗組中幾乎所有的細菌均被殺死，表現出氨基修飾的聚二硫化物高效的殺菌能力。
圖4 氨基官能化聚二硫化物（P2）和陽離子兩親性無規共聚物（P4）的抗菌活性。(A) 具有不同 DP 的 P2 的 MIC結果。DP = 1 表示 P2 的降解產物；(B) 具有不同疏水基團比例的P4 的 MIC結果；(C) 用 P2-55 或 P4-25% (2× MIC) 處理 2 小時，然后進行活/死染色（合并）的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的熒光共聚焦圖像。SYTO 9 染色劑（綠色熒光）通常標記膜完整的細菌（活細菌），而碘化丙啶（PI，紅色熒光）僅穿透膜受損的細菌（死細菌）。
為了探究聚二硫化物的抗菌機理，作者還進行了細胞質膜的去極化實驗（圖5 A-C）。無論是均聚物還是共聚物，對兩種細菌都產生了一定程度的去極化現象，且共聚物產生的去極化現象更為明顯。這些結果還表明，具有更高疏水性的 P4-25% 與細胞膜表現出更強的相互作用，并在細胞膜中停留更長時間。結合掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的形態變化（圖5 D），作者認為富含氨基的聚二硫化物主要通過消除膜電位，誘導膜破裂，最終導致細胞死亡。
圖5 抗菌聚二硫化物誘導的細胞質膜去極化和膜破裂現象。(A) P2-55 在用 DISC3(5) 熒光定量的金黃色葡萄球菌中引起細胞質膜去極化；P2-55 和 P4-25% 對金黃色葡萄球菌 (B) 和大腸桿菌 (C) 的膜去極化百分比。(D) 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用 P2-55 在4× MIC 下處理4小時后的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像。
最后，作者進行了體外溶血和細胞毒性測定以評估抗菌聚二硫化物的生物相容性。P2 和 P4 均顯示濃度依賴性溶血，且不同聚合度的P2 HC50值均超過 800 μg mL−1。用 GSH 降解后，觀察到高濃度下溶血百分比低得多（在 800 μg mL−1 濃度下小于3%），表明降解產物具有很好的生物相容性。在 HeLa 細胞中，測試了 P2-55 和 P4-25%（用 GSH 降解前后）的細胞毒性，結果如圖6 C所示。總體而言，作者認為這類的聚二硫化物的生物相容性在 GSH 引發的快速降解后得到極大改善，從而消除了陽離子抗菌聚合物在使用時通常出現的長期毒性和環境危害的潛在風險。
圖6 氨基官能化聚二硫化物 (P2) 和陽離子兩親無規共聚物 (P4) 的生物相容性。(A) 具有不同 DP 的 P2和降解 P2后的產物（插圖）的溶血結果 (%)。(B) 具有不同疏水比例的 P4 的溶血結果 (%)。(C) 用 P2-55、P4-25%、降解的 P2-55 和降解的 P4-25% 處理的 HeLa 細胞的細胞活力 (%)。
綜上所述，在這項工作中，作者通過陰離子開環聚合，合成了一系列分子量與親疏水基團比例可調、GSH觸發后抗菌活性可按需失活并具有強大殺菌能力的氨基官能化聚二硫化物。這類聚二硫化物的可控合成為開發具有選擇性和強效殺菌能力的新型抗菌劑搭建了分子平臺，為解決抗生素長期存在所帶來的多重耐藥細菌的進化以及不可避免的細胞毒性等問題提供了可能。
