您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2024-05-27 12:54
氨基酸是生命活動的必需物質，20種基因編碼氨基酸組成了蛋白質骨架，在代謝過程中發揮著重要的作用。除甘氨酸外其他氨基酸均有手性中心，分別含L構型和D構型兩種對映異構體。
生理環境是手性的，因此不同構型的氨基酸的生物活性差異很大。L-構型氨基酸可以通過聚合反應形成生命系統中的多肽和蛋白質。在生命系統中也發現某些D-氨基酸以游離氨基酸形式存在或組成多肽、蛋白質的一部分。有文獻報道[1]，某些D-氨基酸是哺乳動物和人體中重要的信號分子。如D-絲氨酸在中樞神經系統中發揮重要作用[2]，D-門冬氨酸則在內分泌系統和神經內分泌系統中發揮作用[3]。
在過去20年里有大量關于氨基酸手性拆分的方法。分析方法基于高效液相色譜法、毛細管電泳、酶和免疫化學生物傳感器等。最常用的方法是高效液相色譜法，一般采用柱前或柱后衍生法提高方法靈敏度。
間接法是基于手性衍生試劑與氨基酸反應形成非對映體，利用非手性固定相對生成的非對映異構體分離；而直接法則基于在手性固定相上分離對映異構體氨基酸。為了有效分離氨基酸對映異構體，研究者采取上述兩種方法，并選擇絲氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸作為研究對象，分別對7-氯-4-硝基苯（NBD-Cl）和2，4-二硝基-5-氟苯基-L-丙氨酸（FDAA）兩種衍生方法進行了比較。
（1）NBD-Cl柱前衍生：200μl 樣品溶液，加200μl硼酸鹽緩沖(100mmol/L，pH8.5)，加200μl NBD-Cl（4mmol/L）混合，混合物渦旋，避光，60℃水浴加熱1小時，在氮氣流保護混合物置50℃下蒸發，蒸發后殘渣溶于1ml流動相。空白溶液用水代替樣品溶液，其他處理方法與樣品溶液保持一致。
色譜條件：手性色譜柱：Sumichiral OA-2500S(250mm*4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流速：0.5ml/min；流動相：甲醇-乙腈（1:1），含檸檬酸5mmol/L；檢測波長:470nm；進樣體積；20μl。
（2）FDAA柱前衍生：200μl 樣品溶液，加40μl碳酸氫鈉溶液（1mol/L），加200μl 1%的FDAA溶液混合，混合物渦旋，避光，40℃水浴加熱1小時。冷卻后加20μl鹽酸溶液（2mol/L）。混合物11873×g離心5分鐘后進液相分析。
色譜條件：非手性色譜柱：Kromasil C18(150mm*4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流速：1.0ml/min；流動相：乙腈-0.2%乙酸（35:65，V/V）；檢測波長：340nm；進樣體積；20μl。
衍生化過程和流動相的組成可能會影響靈敏度和分離度。兩種衍生方法的手性拆分結果如表1所示，從氨基酸的檢出限和定量限看，NBD-Cl衍生方法均低于FDAA衍生方法。但對映體經兩種方法衍生后，分離度無明顯差異。
表1 兩種衍生方法的氨基酸對映體手性拆分結果
研究者以消旋絲氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸作為模型分析物，以NBD-Cl作為衍生試劑，對NBD-Cl的濃度、pH以及衍生反應的溫度和時間進行了優化，優化結果如圖1 所示。
圖1 衍生反應條件的影響
（A：衍生試劑的濃度 B：衍生試劑的pH C：反應溫度 D：反應時間）
由圖1A可知，1mmol/L的氨基酸與4-5mmol/L的NBD-Cl衍生，可以得到最高產率。衍生反應需要在堿性條件下發生，圖1B比較7.5、8.0、8.5、9.0的硼酸鹽緩沖液可知，堿性越強，產率越高，但隨著pH的急劇增加，尤其是當pH超過8.5時，副產物的生成增加。研究者還優化了衍生化反應的溫度和衍生化時間，圖1C和1D可知，反應溫度越高，反應時間越長，產率越高。當溫度高于60℃或反應時間超過60分鐘，反應產率增加的速率變慢。
研究者還對色譜條件進行了優化。分離NBD-氨基酸衍生物時，發現當乙腈比例增加到50%（乙腈：甲醇，V/V）時，有利于氨基酸對映異構體的分離。當流動相中添加一定量的酸時，有助于氨基酸對映異構體的分離，且檸檬酸比甲酸、乙酸、氫氟酸效果更好。
專屬性實驗對11種衍生化D、L氨基酸對映體(圖2 A-K左邊)和空白樣品(色譜圖中未顯示)的色譜圖進行比較，發現空白樣品不干擾氨基酸對映異構體的分離。進樣單一構型的氨基酸衍生物，可知NBD -(D)氨基酸對映體先出峰，NBD-(L)氨基酸對映體出峰在后。
圖2 11對氨基酸對映體分離的典型色譜圖
（左：含0.5%D-氨基酸的L-氨基酸溶液；右：L-氨基酸實際樣品）
（A-K分別為丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸）
線性、檢出限、定量限結果如表2所示，D-氨基酸濃度范圍0.40-3.20μg/ml，均溶于濃度為80.00μg/ml的L-氨基酸溶液中。結果所有待測氨基酸線性曲線，相關系數r＞0.9975，定量限均高于0.40μg/ml。
表2 11種D-氨基酸的線性、檢出限、定量限結果
重復性、中間精密度、回收率結果如表3所示，重復性和中間精密度RSD均低于10%，方法精密度良好。含0.5%的D-氨基酸樣品溶液衍生后，分別于0、2、4、8、12小時進樣檢測，RSD均小于2.4%，方法穩定性良好。樣品檢測結果顯示不含D-氨基酸雜質，回收率實驗分別添加含量為0.5%、1.0%、2.0%的D-氨基酸雜質進行驗證，結果RSD均小于3%，方法準確性良好。
表3 11種D-氨基酸的精密度、重復性、回收率結果
綜上所述，作者開發了一種檢測一系列L-氨基酸對映異構體純度的高效液相色譜法。方法以NBD-Cl柱前衍生氨基酸以提高檢測靈敏度，衍生后的氨基酸對映異構體通過手性柱分離，流動相含0.1%檸檬酸的甲醇-乙腈（1:1）溶液，流速：0.5ml/min。檢測波長：470nm。11對氨基酸異構體均可分離。在L-氨基酸大量過量的前提下，仍可對微量的D-氨基酸（0.5%）異構體進行定量。該方法經過專屬性、精密度、線性、定量限、檢出限、準確度驗證，并成功應用于大量樣本的檢測。
參考文獻
[1]Friedman, M. (2010). Origin, microbiology, nutrition and pharmacology of D-amino acids. Chemistry & Biodiversity, 7, 1491–1530.
[2]Fuchs, S. A., Dorland, L., de Sain-van der Velden, M. G., Hendriks, M., Klomp, L. W.,Berger, R., et al. (2006). D-serine in the developing human central nervous system. Annals of Neurology, 60, 476–480.
[3]Yamamoto, A., Tanaka, H., Ishida, T., & Horiike, K. (2010). D-aspartate oxidase localisation in pituitary and pineal glands of the female pig. Journal of Neuroendocrinology, 22, 1165–1172.
來源：Internet
