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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-10-22 08:22
轉(zhuǎn)染是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要技術(shù)，是指將外源性的DNA、RNA等導(dǎo)入目的細(xì)胞的過程，主要用于調(diào)控基因表達(dá)，從而研究基因功能。以下以研究腎缺血再灌注損傷模型中慢病毒包裝過表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）線粒體分裂基因drp1為例介紹轉(zhuǎn)染相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟。
一、質(zhì)粒提取（輔助質(zhì)粒PMD2.G、PSPAX2，目的質(zhì)粒）
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、配制LB固體培養(yǎng)基（加氨芐）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉15g，加入1000 mL水。需高壓滅菌，待溫度降至40-50℃時(shí)，加入適量氨芐，混勻后倒板。
2、劃線：待板中培養(yǎng)基冷卻至室溫后，將接種環(huán)用酒精燈滅菌后在酒精燈周圍蘸取菌液并依次劃線，然后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3、搖菌：挑去板中出現(xiàn)的單個(gè)菌落至裝有15 mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，瓶蓋適當(dāng)擰松，置于37℃搖床上200rpm 12-16h。
4、離心：將含有菌液的離心管1000rpm，室溫離心5min。
5、提取：棄去離心管中菌液，用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。
6、測(cè)濃度：用分光光度計(jì)測(cè)取各提取質(zhì)粒濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
1、配制LB固體培養(yǎng)基加入氨芐時(shí)，需控制好溫度。溫度過高，會(huì)使得氨芐失去活性；溫度過低，則會(huì)使氨芐混合不均勻，且容易凝固。通常情況下，以手能握住玻璃瓶15s為宜。
2、常用氨芐濃度為100mg/mL，加入量為100μL/100mL。
3、LB固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基配制的區(qū)別在于是否加入瓊脂粉。
4、劃線通常采用四區(qū)劃線法，每個(gè)區(qū)不能有重疊，首尾不能接觸，逐漸稀釋以便于長(zhǎng)出所需的單個(gè)菌落。
5、劃線時(shí)，注意不能劃破瓊脂培養(yǎng)基，以防止造成污染。
6、劃線結(jié)束后，長(zhǎng)出單個(gè)菌落即可挑菌，若菌落太小，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間；若時(shí)間過長(zhǎng)，可能導(dǎo)致交叉污染。
7、須挑取單個(gè)菌落，不可挑去多個(gè)單菌落，這樣會(huì)導(dǎo)致提取的質(zhì)粒純度降低，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。
8、搖菌時(shí)，不可時(shí)間過長(zhǎng)，以12-16h為宜，太長(zhǎng)可能會(huì)造成菌體變異；時(shí)間太短，會(huì)影響質(zhì)粒提取效果。
二、轉(zhuǎn)染步驟
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、293T細(xì)胞準(zhǔn)備：復(fù)蘇293T于培養(yǎng)瓶中，觀察293T狀態(tài)至傳代至少3次。傳代后的293T長(zhǎng)滿后傳至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞狀態(tài)。
2、換液：培養(yǎng)瓶中293T密度達(dá)70-80%時(shí)，提前1h換液。
3、轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制：A液：3μg PSPAX2 ；1.5 μg PMD2.G；3μg Target，用無血清DMEM培養(yǎng)基或Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊至1.5mL。B液：加入22.5μL PEI（1μg/μL）至1.5mL無血清DMEM培養(yǎng)基或Opti-MEM培養(yǎng)基。
4、靜置：A,B液分別配好后，室溫靜置5min。
5、混合：將B液緩慢懸空滴加至A液，順序不可反。
6、靜置：混合后，室溫靜置20min。
7、轉(zhuǎn)染：棄去293T培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，將上述混合緩慢加入293T細(xì)胞。
8、換液：6h后棄去混合液，換成293T細(xì)胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
1、轉(zhuǎn)染前，要確保293T細(xì)胞狀態(tài)，否則影響轉(zhuǎn)染效率。
2、新復(fù)蘇的293T狀態(tài)欠佳，不利于轉(zhuǎn)染，至少3代以后。
3、轉(zhuǎn)染前293T密度不能過大，太滿后續(xù)容易飄；密度過低則影響產(chǎn)毒效率。
4、轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制因細(xì)胞系及自身經(jīng)驗(yàn)可能不同。
5、加入B液時(shí)，必須緩慢滴加。
6、換液時(shí)，動(dòng)作要輕柔，不可對(duì)著293T細(xì)胞。
三、病毒收集
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、24h收集病毒：換液后24h收集病毒至15ml離心管中，并更換新的培養(yǎng)基（含血清不含雙抗DMEM培養(yǎng)基），并將收集到的病毒置于4℃。
2、48h收集病毒：48h后再次收集病毒至上述離心管中，置于4℃冰箱。
3、配制病毒濃縮液：即5× PEG 8000，NaCl 8.766g+PEG 8000 50g，溶于200mL純水，高溫高壓滅菌，保存于4℃。
4、離心：將收集到的病毒4℃，3000rpm，離心15min，去除細(xì)胞碎片。
5、過濾：用注射器吸取上清，用0.45μM濾膜過濾至15mL離心管中。
6、濃縮：用移液槍吸取PEG8000，向病毒液中加入1/4體積的5× PEG8000，并立即顛倒混勻，置于4℃。每30min顛倒5-10次，總共操作5-6次。
7、靜置：于4℃靜置過夜，白色沉淀物即為病毒。
8、離心：4℃，4000g，離心20min。
9、重懸：棄去上清，用適量冷PBS或無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，并分裝至1.5mL EP管中。
10、存放：將分裝好的病毒液放至-80℃冰箱保存，或者用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
1、收集病毒時(shí)，含血清不含雙抗的培養(yǎng)基產(chǎn)毒效率較高。
2、兩次收集的毒液可混合，也可分開，一般48h產(chǎn)毒較多。
3、離心機(jī)離心前，均需預(yù)冷。
4、棄上清時(shí)，動(dòng)作要輕柔，避免吸到病毒。
四、感染目的細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、準(zhǔn)備HK-2細(xì)胞：將生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HK-2細(xì)胞傳至新培養(yǎng)瓶中，觀察細(xì)胞狀態(tài)及密度。
2、換液：待HK-2細(xì)胞密度為50-70%時(shí)，給細(xì)胞換液。
3、加毒：向病毒液中加入ploybrene ，混合后加至目的細(xì)胞中，并使ploybrene終濃度達(dá)8μg/mL，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4、換液：24h后，更換新的DMEM-F12培養(yǎng)基（含血清+雙抗）。
5、篩選：繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進(jìn)行帶抗性的穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。
6、驗(yàn)證：用熒光顯微鏡或WB、PCR驗(yàn)證效果。
注：由于篇幅有限，步驟5、6本文不作詳細(xì)講解。
注意事項(xiàng)：
1、感染前，要確保目的細(xì)胞活性及密度。
2、Ploybrene濃度因細(xì)胞系及經(jīng)驗(yàn)不同可能不同。
3、待細(xì)胞活性恢復(fù)后，再進(jìn)行篩選。
4、若有熒光對(duì)照，可根據(jù)熒光判斷轉(zhuǎn)染的效率；但HK-2細(xì)胞系的drp1過表達(dá)效果還需WB、PCR等做進(jìn)一步驗(yàn)證。
來源：實(shí)驗(yàn)老司機(jī)
