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前言

免疫原性一般是指藥物和/或其代謝物誘發(fā)對自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力[1]。免疫反應(yīng)的影響可以是無臨床意義抗藥抗體的出現(xiàn)，也可以嚴(yán)重到危及生命。免疫原性研究一直是藥物研發(fā)的重要組成部分，貫穿藥物研發(fā)-非臨床研究-臨床研究-上市后藥物監(jiān)測的整個生命周期。抗藥抗體 (Anti-drug antibody, ADA)是藥物免疫原性評價的主要方式。目前的大分子類型藥物包括單克隆抗體（mAbs）、融合蛋白、重組蛋白、基因治療產(chǎn)品、疫苗，特別是新型疫苗（如mRNA疫苗）、細胞治療產(chǎn)品（如CAR-T細胞療法）等，都是可能引起免疫原性的新分子類型。本文將從免疫原性的形成機制和影響因素、對藥物研發(fā)產(chǎn)生的影響出發(fā)，介紹常用的檢測免疫原性的策略、如何選取合適的分析平臺和檢測形式以及分析方法面臨的挑戰(zhàn)。

1、抗藥抗體的形成機制

治療性蛋白藥物引起的機體免疫反應(yīng)包括天然免疫和適應(yīng)性免疫。天然免疫是生物體非特異性、無記憶性的病原體防御功能，用以抵御病原體入侵的第一道防線，特定的藥物類型在特殊病人群體也可能誘導(dǎo)天然免疫系統(tǒng)的響應(yīng)。而我們一般討論與監(jiān)測的更多是治療性蛋白藥物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。適應(yīng)性免疫包括細胞免疫介導(dǎo)的細胞因子釋放作用和體液免疫介導(dǎo)的抗藥抗體的產(chǎn)生。

體液免疫主要通過B細胞產(chǎn)生的針對治療性蛋白的抗藥抗體來發(fā)揮作用。抗藥抗體不僅包括結(jié)合藥物的抗體，也可以是阻斷其功能的中和抗體。如圖1所示，根據(jù)產(chǎn)生機制通常可分為T細胞依賴途徑和非T細胞依賴兩種機制。實際上，由于免疫復(fù)合物或者聚集物都能夠從不同程度上激活這兩種途徑，并且兩種途徑均會產(chǎn)生ADA，使得這兩種機制并無明顯區(qū)別，它們會相互作用并增加對方的作用強度。

圖1. 抗藥抗體的產(chǎn)生機制[2]

2、免疫原性產(chǎn)生因素及對藥物研發(fā)的影響

ADA的產(chǎn)生最初與第一批上市抗體含有大量的小鼠序列有關(guān)。它們被人體免疫系統(tǒng)識別為異物是免疫原性出現(xiàn)的關(guān)鍵步驟。為了解決該問題，生物工程的進步產(chǎn)生了嵌合(鼠-人)抗體、人源化抗體和全人源抗體[3]。然而，盡管免疫原性降低，但并沒有完全消除。免疫原性的產(chǎn)生是由多因素共同作用的結(jié)果，可以分為與患者相關(guān)的因素（患者的免疫力狀態(tài)和免疫能力、遺傳因素、預(yù)存抗體、給藥途徑、劑量和頻率）和與藥物相關(guān)的因素（產(chǎn)品的來源、結(jié)構(gòu)、聚合物的形成、糖基化、聚乙二醇化、雜質(zhì)、處方、包裝和儲存等）。美國藥典通則1106對這些影響因素進行整理歸納，主要可以分為低、中、高風(fēng)險3個方面。

表1. 影響免疫原性產(chǎn)生的因素[4]

ADA 會對藥物暴露、藥物代謝動力學(xué)特征、藥效、藥物毒性作用等造成影響。ADA與藥物結(jié)合，可能會增加或減少藥物的清除、影響半衰期和組織分布、改變藥物的暴露水平和藥代動力學(xué)特征、影響對藥物毒性作用的評價及對臨床研究中起始劑量的評估；中和抗體會中和藥物的活性、降低藥物的藥效作用；ADA與藥物及相似內(nèi)源性蛋白（具備相似表位）結(jié)合后，可能會導(dǎo)致該蛋白缺陷綜合征，引起相應(yīng)毒性作用；對藥物的免疫應(yīng)答可能會導(dǎo)致過敏反應(yīng)、自身免疫等，ADA-藥物免疫復(fù)合物沉積可能引起免疫病理變化和相關(guān)不良反應(yīng)[5]。

3、免疫原性檢測策略

對于ADA的檢測，NMPA、FDA、EMA的指導(dǎo)原則均從免疫原性的檢測流程維度分為篩選、確證和表征3個階段。如圖2所示，首先對所有樣品進行篩選試驗，其次對陽性樣品的特異性進行確證試驗，對已確定的陽性樣品進行滴度試驗，以及通過功能性試驗對抗體中和活性進行檢測。其中在已確定的陽性樣品中，還應(yīng)考慮確定抗體同種型、亞型和結(jié)合表位的檢測。3個指導(dǎo)原則對于方法學(xué)驗證的參數(shù)基本相同，但NMPA和FDA的指導(dǎo)原則給出了更加具體的要求和做法，而EMA相對寬泛。ADA檢測的方法學(xué)驗證內(nèi)容通常包括篩選臨界值、確證臨界值、分析方法靈敏度、精密度、選擇性、藥物耐受性、特異性、穩(wěn)健性、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性等，表2總結(jié)了3種指導(dǎo)原則需要的驗證參數(shù)。

圖2. ADA檢測的分級評估策略[1]

表2. 3種指導(dǎo)原則驗證參數(shù)的比較匯總[6-8]

注：+：有相關(guān)參數(shù) -：無提及

對于細胞因子釋放試驗，EMA并未要求，F(xiàn)DA也僅是簡單提及，而NMPA首次將體外細胞因子試驗提到法規(guī)層面，對體外細胞因子試驗的策略、基本觀察指標(biāo)做了要求：基于細胞因子釋放機制，設(shè)計合適的體外細胞因子釋放試驗，如果藥物直接靶向免疫細胞，可采用外周血單個核細胞進行試驗，如果機制可能與FcγRs結(jié)合相關(guān)，則更適合在包含表達FcγRs細胞的全血中進行試驗，觀察指標(biāo)包括但不限于IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α[1][6][7][8]。

4、檢測平臺和檢測形式的選擇

由于免疫原性會嚴(yán)重影響藥物的有效性和安全性，藥監(jiān)部門要求所有治療性蛋白藥物都要進行免疫原性檢測，F(xiàn)DA對其給出的具體要求是高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性及高親和力。而ADA的檢測和確認比較復(fù)雜，檢測結(jié)果會受到所使用的分析方法的影響。包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、放射免疫沉淀法（RIPA）和表面等離子體共振法（SPR）。根據(jù)表3所列出的各平臺分析方法的優(yōu)缺點，可以挑選出合適的分析平臺，規(guī)避可能出現(xiàn)的問題。

表3. 各免疫原性分析平臺優(yōu)缺點對比

另外，F(xiàn)DA在2018年統(tǒng)計了當(dāng)時近五年的申報方法，其中ADA的檢測以ECL和ELISA平臺為主，中和抗體檢測以細胞實驗和競爭配體結(jié)合實驗平臺為主。在檢測形式上又分為直接法和橋接法。

圖3. ELISA直接法示意圖

圖4. ECL橋接法示意圖

案例分享

在內(nèi)部驗證試驗中，采用ECL橋接法檢測了曲妥珠單抗給藥后大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗藥抗體。該方法對篩選臨界值、確證臨界值、分析方法靈敏度、耐藥性、精密度、選擇性、穩(wěn)定性等參數(shù)進行了確證。其中靈敏度可做到0.382 ng/mL，耐藥性可做到陽性對照為500 ng/mL時可耐受200 μg/mL。

實驗入組共6只大鼠，采用交叉取點的方式，采集了8個時間點，共24個樣本。首先通過篩選試驗確認了8個樣本為陽性，再通過確證實驗確定4個樣本為假陽性，最后通過titer實驗來表征抗體的相對含量，結(jié)果顯示這4個樣本滴度從10200-68000不等。

表4. 曲妥珠單抗給藥后大鼠體內(nèi)試驗結(jié)果匯總

注：/：未進行該實驗

5、免疫原性分析方法的挑戰(zhàn)

作為評估方法學(xué)性能的關(guān)鍵試劑，陽性對照抗體直接影響檢測方法的靈敏度和藥物耐受水平。選擇合適的陽性對照抗體，對抗藥抗體檢測方法學(xué)的開發(fā)和驗證至關(guān)重要。一般選擇免疫動物制備多克隆抗體作為陽性對照抗體。

治療性蛋白藥物由于給藥劑量大、半衰期長，循環(huán)中的高濃度藥物給免疫原性的評估帶來了很大挑戰(zhàn)。ADA檢測會受到樣品基質(zhì)中藥物的干擾，過量的藥物與 ADA 結(jié)合，會造成 ADA 檢測假陰性結(jié)果。目前在ADA分析中，有多種方法可以用來提高藥物耐受性，減少或避免由于游離藥物的存在而造成的假陰性結(jié)果，防止對ADA的低估。由于ADA在樣品中會有兩種存在形式，即游離ADA和ADA-藥物復(fù)合物[9]。為了減少在ADA檢測過程中受到的各種干擾，需要對樣品進行前處理，應(yīng)該考慮每種藥物的特點、檢測目的、風(fēng)險評估、靈敏度目標(biāo)、操作難易程度及可行性等，選擇適用的分析方法。如表5所示，我們對比了不同處理方法對藥物耐受性的影響。

表5. 不同處理方法藥物耐受性對比

另外，對于單抗藥物，可溶性靶標(biāo)的干擾也是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。可溶性的二聚體或多聚體藥物靶標(biāo)可以在兩個標(biāo)記藥物分子之間形成橋梁，容易導(dǎo)致ADA假陽性結(jié)果。而當(dāng)只能與其中一種抗體結(jié)合時，又會造成空間位阻，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。目前通常采用的解決方法是將基質(zhì)中的可溶性靶點進行清除，通常可以用靶點抑制劑（一般為相應(yīng)的抗靶點抗體）去結(jié)合靶點，可去除靶點的干擾作用，提高靶點耐受性[10]。

結(jié)語

隨著科技的進步，新的治療性蛋白藥物和治療方式必將成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的焦點，而免疫原性仍然是生物療法發(fā)展中要面對的一個重要問題。作為一種跨學(xué)科的方法，免疫原性評估需要生物分析、生物化學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科的密切配合。

參考文獻：

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心“藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則”，2021年3月

[2] Ulitzka M., Carrara S. C., Grzeschik J., et al. Engineering therapeutic antibodies for patient safety: tackling the immunogenicity problem[J]. Protein Engineering Design and Selection, 2020: 33

[3] Singh, Surjit, et al. "Monoclonal antibodies: a review." Current clinical pharmacology 13.2 (2018): 85-99.

[4] <1106> Immunogenicity Assays - Design and Validation of Immunoassays to Detect Anti-Drug Antibodies

[5] Michael Ulitzka, Stefania Carrara, Julius Grzeschik, Henri Kornmann, Björn Hock, Harald Kolmar, Engineering therapeutic antibodies for patient safety: tackling the immunogenicity problem, Protein Engineering, Design and Selection, Volume 33, 2020, gzaa025, https://doi.org/10.1093/protein/gzaa025

[6] Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. May 2018.

[7] Draft ICH Guideline M10-Bioanalytical Method Validation (EMEA/CHMP/EWP/172948/2019). March 2019

[8] EMA Guideline on bioanalytical method validation (EMEA/CHMP/EWP/192217/2009), adopted 21 July 2011

[9] Gunn GR， Sealey DC， Jamali F，Meibohm B，Ghosh S，Shankar G. From the bench to clinicalpractice：understanding the challenges and uncer?tainties in immunogenicity testing for biopharma?ceuticals［J］. Clin Exp Immunol，2016，184（2）：137-146.

[10] 邵雪,洛文靖,王海學(xué),等.可溶性靶點分子對生物制品抗藥抗體橋連法檢測的挑戰(zhàn)和應(yīng)對策略[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2019, 33(11):6.DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2019.11.011.