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免疫原性是大部分生物藥物（疫苗除外）都不愿意碰到的風險因素。免疫原性最初引起人們注意是源自重組人促紅細胞生成素的悲劇，很多患者用藥后出現了再生障礙性貧血。目前常用的免疫原性檢測范式是篩選、確認和表征（滴度檢測）三級檢測。篩選的目的是去除陰性樣本，畢竟不太可能對所有樣本開展滴度檢測。但篩選也保留了一定的假陽性率。所以，確認這一步目的就是去除假陽性樣本。最后一步是對確認陽性的樣本進行滴度檢測。

多國藥品監管機構均出臺過免疫原性相關指導原則，FDA 2019年出臺的《Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products-Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. Guidance for Industry》，EMA 2017年出臺的《Guideline on Immunogenicity Assessment of Therapeutic Proteins》，NMPA 2021年出臺的《藥物免疫原性研究技術指導原則》，PMDA 2024年出臺的《Guidelines for Immunogenicity Assessment of Biopharmaceuticals》草案。指導原則雖然是免疫原性研究的重要參考文件，但指南的變更通常需要時間，有些也滯后于工業界、臨床或者患者出現的最新情況。最近幾年，工業界對于免疫原性研究提出了諸多疑問，比如三級檢測范式是否依然適用？采用信噪比（signal to noise）替代滴度檢測是否可行？而且，隨著新型生物制品的不斷出現，傳統檢測范式的應用也有諸多需要討論之處。

帶著這些疑問，歐洲生物分析論壇（European Bioanalysis Forum, EBF）2023年在西班牙組織了一次主題為“Challenging the Current Paradigm for ADA testing”的討論，略作分享。

首先看下篩選、確認和滴度三級檢測范式是怎么來的。逐級檢測其實最早是參考疫苗類產品。不過疫苗的目的就是利用滴度表征免疫反應，如抗體產生，而且疫苗通常產生的是比較強的免疫反應。反觀傳統治療性生物制品，是不需要產生，也不希望產生非預期免疫反應的。這點與疫苗截然相反。所以，EBF認為采用疫苗的免疫原性檢測策略對其他類型生物制品進行表征，是存在先天缺陷的。EBF建議免疫原性應該按照biomarkers的思路進行表征。Biomarkers的定義是“A defined characteristic that is measured as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or biological responses to exposure or intervention, including therapeutic interventions”。其實，免疫原性也可算作藥物暴露或者干預后，出現的生物學反應。如果這一思路成立，那現有的免疫原性三級檢測范式及閾值的使用，可能就會受到挑戰。畢竟，沒太見過采用三級檢測范式表征biomarkers的情況。

三級檢測范式

典型的免疫原性三級檢測步驟如下圖所示，先對樣本進行第一級的篩選，之后對篩選陽性的樣本加樣確認，最后對確認陽性的樣本進行滴度檢測和中和活性確認。實際工作中，并不是對所有階段的臨床樣本均進行完整的三級檢測。比如，中和活性檢測通常在關鍵三期臨床才開展。

目前三級檢測范式的其中一個缺點是“過于保守”，篩選階段和確認階段分別有5%和1%的假陽性率（false positive rate），以最大程度覆蓋ADA陽性的樣本。另外，篩選和確認階段采用的檢測原理通常是一樣的，常見的是用包被的樣品捕獲，標記的樣品檢測，惟一的區別是后者額外加入了樣品進行競爭。帶來的實際效果是，確認階段幾乎很少大幅度降低篩選階段的陽性樣本。篩掉的基本都是篩選階段信號值在cut point附近的樣本。直接后果是本來ADA真陽性的樣本可能被誤殺，假陽性的樣本則污染了最終結果。Kudiak等人做過研究，發現移除確認階段，直接把篩選階段的假陽性率設置成1%，效果與目前篩選5%+確認1%是一樣的。另外，滴度檢測實際上就是把所謂的陽性樣本，通過多級稀釋，直至cut point值或以下，以半定量形式評估ADA陽性的程度。但滴度檢測所用的format與篩選和確認還是一樣的。這就相當于，同一個樣本，被同一種檢測方案，“折騰”了3次。

EBF圓桌會議討論認為是否包括確認階段應該基于分子的風險而定，而不是一種機械操作，即所有分子均包含確認測試。如果排除確認步驟，篩選步驟的假陽性率應調整為1%，而不是5%。可以在早期臨床ADA樣本檢測時，包含確認步驟，同時伴隨1%假陽性的篩選，以判斷將確認步驟剔除是否有影響。

信噪比（signal/noise, S/N）替代滴度檢測

EBF認為S/N途徑已經有大量數據和公開文獻支持。建議向監管機構提交免疫原性檢測策略時，企業可以將S/N作為一種方案，與監管機構進行討論。EBF認為S/N>x，可以替代現有的滴度>y，同樣能說明機體對于藥物是否出現臨床意義的反應。另外，抗藥抗體一般都非常穩定，可以將樣本保留，如果監管機構提出異議，再行滴度檢測。

表征測試

很多生物藥物具備雙靶點、三靶點特異性，或者融合、偶聯了其它分子。很多公司對這類產品免疫反應表征時想研究清楚到底是分子的哪個部分產生的免疫原性風險。當然，這并不是來自監管機構的考量，更多是出于企業內部決策，為后續產品開發或者平臺優化提供依據。另外一點是關于中和活性的表征。除非是高風險分子，企業通常會將中和活性檢測放在3期關鍵臨床階段開展。FDA回溯2019年1月-2022年12月批準上市的生物制品，5.4%用滴度+PK/PD數據替代中和活性檢測，21.7%未開展任何中和抗體檢測。

EBF認為是否開展額外的表征，需要基于產品風險而定。如果要開展，由于這類表征方法的復雜性，需要盡早開始對關鍵試劑的開發和表征。

單孔分析

其實單孔分析在PK檢測中比較多見，ICH M10《生物分析方法驗證及樣品分析》中也有相關描述。不過，雖然監管機構指南中未做要求，但免疫原性檢測中還是以復孔為主。免疫原性檢測一般采用bridging assay format，其中一步是將標記的試劑與樣本或陽性對照進行孵育，孵育采用單孔，后續從該單孔中吸取樣本加入到兩個復孔之中。從科學性角度，這種操作除了測試加樣手法，并無價值，也失去復孔檢測精密度的意義。

EBF認為免疫原性單孔分析可以接受，監管并無復孔要求。而且，單孔對樣本量要求更低，更加符合患者為中心的思想。需要的樣本儲存空間、微孔板、試劑量也大大減少。

藥物耐受性

研究樣本中通常含有一定濃度的受試藥物，可能會對免疫原性檢測造成影響，比如假陰性的出現。因此，方法開發過程中要注意方法能否耐受高濃度藥物。EMA免疫原性指導原則中提到，免疫原性方法的藥物耐受水平要超過待測樣本中的藥物濃度。當然，EMA也承認有時可能會遇到技術困難，所以也強調盡可能開發最佳測試方法。

還有一點需要注意。ADA藥物耐受性驗證是采用陽性對照樣本完成的。眾所周知，ADA陽性對照與體內真實樣本中的抗藥抗體并不相同，所以方法驗證中的藥物耐受水平僅是一個估計值。

EBF認為如果可能，取樣時間點盡可能仔細選擇，比如血藥濃度較低時間點的樣本。另外，選擇藥物耐受性的藥物濃度時，也需要結合臨床研究進行設計。可以采用100ng/mL濃度的陽性對照進行藥物耐受性方法開發，如果100ng/mL有困難，可以考慮采用250、500ng/mL。對于低免疫原性風險的分子，僅在篩選階段進行藥物耐受驗證即可。對于風險較高的分子，可以在篩選、確認階段均進行。通常不在滴度檢測中開展藥物耐受驗證。另外，藥物耐受驗證通常僅開展1個驗證批就可以。最后，EBF建議如果藥物耐受水平達不到，盡早與監管機構進行溝通。

安慰劑組ADA樣本檢測

在臨床PK研究中，通常不對安慰劑組患者采樣，也不用額外做出解釋。但是，免疫原性研究中，有些公司會對安慰劑同樣檢測，增加了成本，浪費了時間，實際并無太大價值。當然，產生這種狀況也有些客觀原因，比如中心實驗室并未揭盲，不知道哪些樣本來自安慰劑組。或者通過隨機碼確認哪些樣本不包含藥物有一定挑戰。也可能就是想確認下開發的ADA方法是否符合預期，畢竟安慰劑組大多ADA陰性。

EBF則建議除非有正當合理的理由，安慰劑樣本無需檢測。即使檢測，僅在早期研究中挑個別時間點即可。

最后

EBF其實發布了很多免疫原性相關的文章。傳統的三級檢測范式已經用了很多年，同一個樣本，采用同一種檢測format測3遍，且很多時候，確認較篩選額外貢獻的價值有限。故，EBF提出的采用篩選階段的S/N，不再進行確認和滴度檢測，也不設置cut point，將所有S/N數據繪制并呈現出來。這樣，所有患者的ADA產生情況僅以1個S/N數據判定。如果這個思路能行得通，那整個檢測效率、成本、數據解讀等不是現有的三級檢測模式可比的。最后，ADA并不是孤立的，單獨的ADA并未太大意義，ADA最終還是要與PK、PD或毒性進行關聯分析。當然，這篇文章僅代表AstraZeneca、Merck KgaA、Pfizer、Sanofi、Charles River、Labcorp、Roche等工業界的觀點，不確定FDA或者EMA是否有類似先例成功申報并獲批。